管修汉，陈雄金，陈晓东，罗泽斌，陈 琳，崔理立，赵 斌,3，麦 晖,3（广东医科大学附属医院 .放射科；.神经病学研究所；3.神经内科，广东湛江 5400）

阿尔茨海默病(Altheimer’s Disease，AD)是一种起病隐匿、呈渐进性发展的神经变性疾病，临床上以认知功能减退为主要表现。其发生机制尚不明确，但Aβ级联蛋白学说是AD诸多发病机制中较为公认的一项学说，以β淀粉样蛋白(Aβ)沉积为主要致病因素是AD发生发展的重要环节。因此，对Aβ 环节的干预、减少Aβ的沉积以及由沉积而引致的神经毒性损伤是治疗AD的关键[1-2]。随着精准治疗的提出，从基因水平对AD进行干预治疗的研究越来越多[3]，相应的对干预治疗效果的判断要求也越来越高，需要AD影像学结合行为学改变的特点以及病理学的变化以探讨AD干预的疗效。铁代谢紊乱是AD 的特征表现，研究发现Aβ沉积内铁蛋白含量增高[4-5]。磁共振脑铁成像技术能实现在活体中无创、可重复地评估AD患者脑内铁含量的改变[6]。Jack等[7-8]的研究表明中晚期APP/PS1双转基因小鼠FSE序列行T2WI冠状扫描表现为小鼠脑内皮层及海马区散在的点状低信号影，且T2信号强度比值可以作为一个半定量指标来评价脑内病变的信号改变。APP/PS1双转基因小鼠因可在短期内大量产生Aβ42及Aβ寡聚体，出现拟AD的病理改变，且随着月龄增加这些病理改变会逐渐加重，成为目前AD研究的首选动物模型[9]。因此本研究分别选用了中期(12月龄)、晚期(18月龄)的APP/PS1双转基因小鼠，给予miRNA-146a干预治疗后，运用3.0T磁共振T2WI成像对海马区与同侧肌肉的T2信号强度比值进行测量，以期能半定量反映AD脑组织内铁代谢的改变，判断APP/PS1双转基因小鼠的成模情况及其在miRNA-146a干预下的疗效。

1 材料和方法

1.1 试剂

miR-146a agomir 和DEPC (Diethyl pyrocarbonate)为广州艾基生物技术有限公司产品。

1.2 实验动物

SPF(specific pathogen free)级12月龄APP/PS1双转基因小鼠10只，18月龄8只，12月龄相同背景非转基因野生型小鼠(C57BL/6型，简称C57小鼠)5只，18月龄4只，均为雄性，体质量为24.0～43.4 g。试验动物均由广东省实验动物中心提供，饲养于广东医科大学实验动物中心SPF级房，22～26 ℃，湿度为55%～65%，12 h光暗周期条件下饲养，自由获取食物和水源。本实验已通过广东医科大学伦理委员会伦理审核，及遵循相应动物实验操作规范。

1.3 动物分组

随机将12月龄AD小鼠分为AD组和干预组，每组5只，12月龄C57小鼠5只作为正常组；随机将18月龄AD小鼠分为AD组和干预组，每组4只，18月龄C57小鼠4只作为正常组。

1.4 实验动物给药

按照Hanson等[10]方法给予小鼠鼻腔滴注入。(1)将实验剂量1 nmol miR-146a agomir溶于24 μL无酶的DEPC水中，冰盒中保存。(2) 在正式实验前2周，用2.5 μL移液枪给小鼠以生理盐水滴鼻使小鼠适应。正式实验时，干预组给予配好miR-146a agomir液体经移液枪每次单鼻孔给予1 μL滴注，两个鼻孔之间交替滴注，总量达8 μL后，给予小鼠休息5 min，使miR-146a agomir得到充分吸收，再进行下一个轮回，共3个轮回将24 μL滴注完。隔天干预1次，共15次。AD组和正常组小鼠均给予同等体积的载体DEPC水。

1.5 磁共振检测

干预30 d后，次日所有实验动物送至广东医科大学附属医院磁共振室，腹部注射5%水合氯醛进行麻醉(麻醉量：体质量×0.06 mL/g)后，装入8通道横向放置老鼠线圈然进行MRI检查。

1.5.1 设备及成像参数 采用GE Signa Excite HD 3.0T超导磁共振系统，3.0T 8通道横向放置老鼠线圈。主要扫描序列为冠状T2WI和T1WI。FSE序列T2WI成像扫描参数：重复时间=3 000 ms，回波时间=68 ms，频率=288，相位=288，激励次数=6次，带宽=31.25 kHz，回波链长度=12，层厚=0.8 mm，层间距=0.5 mm，频率编码视野=5.0 cm×5.0 cm，相位视野=0.70。FSE序列T1WI成像扫描参数：重复时间=480 ms，回波时间=最小值，频率=320，相位=256，激励次数=6次，带宽=31.25 kHz，回波链长度=3，层厚=0.8 mm，层间距=0.5 mm，频率编码视野=5.0 cm×5.0 cm。扫描方法：先进行常规三平面定位扫描，然后进行小FOV三平面再一次定位扫描，在三平面点位图像上进行常规冠状T2WI及T1WI序列扫描。扫描范围：平行双侧外耳道行小鼠全脑扫描。

1.5.2 图像后处理及数据测量 扫描完成后将图像传至GE Medical Systems Functool 4.4工作站，在T2WI图像上选取海马和相同侧的肌肉为感兴趣区进行测量，测量时ROI大小均为1 mm2。数据测量采用盲法，在未知组别的情况下由1名影像医师勾勒出相关感性趣区面积并进行测量和记录数值。每间隔1个月再由同一医师进行重复测量，共测量3次，取平均值作为T2WI信号强度比值。

1.6 统计学处理

选用SPSS 19.0统计软件进行分析，计量资料以±s表示，采用单因素方差分析及LSD检验。P<0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 常规MRI成像

如图1所示，与正常组比较，AD组小鼠显示的海马区散在点状T2WI低信号影增多，经miRNA-146a干预治疗后(干预组)的小鼠海马区T2WI信号较相同月龄AD组的小鼠强。

2.2 T2WI信号强度比值的比较

12和18月龄AD组小鼠的T2WI信号强度比值均比正常组降低(P<0.05或0.01)；干预组的T2WI信号强度比值则高于AD组(P<0.01)，与正常组比较差异无统计学意义(P>0.05)。详见表1。

2.3 中晚期小鼠的肌肉信号分析

中晚期各组小鼠的肌肉信号相对稳定，组间比较差异无统计学意义(P>0.05)，详见表2。

表1 各组间T2WI信号强度比值的比较(±s)

表1 各组间T2WI信号强度比值的比较(±s)

AD组与同龄正常组比较：a P<0.05，bP<0.01；干预组与AD组比较：cP<0.01

images/BZ_23_1312_547_2241_618.png正常组2.26±0.29 2.95±0.11 AD组1.81±0.31a 12月龄18月龄12月龄18月龄12月龄18月龄5 4 5 4 5 4 2.09±0.14b干预组2.34±0.20c 2.65±0.04c

表2 小鼠肌肉T2WI信号值分析(±s)

表2 小鼠肌肉T2WI信号值分析(±s)

各组比较均P>0.05

images/BZ_23_1312_1236_2241_1307.png正常组2 882.40±576.91 2 854.25±206.85 3 739.00±746.27 3 418.25±655.45 3 231.40±704.00 2 664.00±135.19 AD组干预组12月龄18月龄12月龄18月龄12月龄18月龄5 4 5 4 5 4

3 讨论

3.1 APP/PS1双转基因小鼠

图1 干预后小鼠核磁共振检测海马区中Aβ沉积情况

目前认为老年斑(SP)是AD的主要病理改变，而Aβ是SP的主要成分[11]，研究发现，Aβ在脑内沉积对神经细胞的毒性是AD发病的关键因素[12]。在与AD发病的相关基因内，目前研究热点主要包括位于21号染色体上的β淀粉样前体蛋白(APP)基因和位于14号染色体上的早老素-1(PS-1)基因。转基因模型小鼠是建立在基因遗传基础上，将外源性基因引入野生型小鼠内，通过繁殖并基因遗传，后代过多地表达该基因后而逐渐出现AD相关的病理学以及行为学改变。Janus等[13]报道单纯PS-1转基因小鼠并没有出现渐进性认知障碍。由于AD是多基因参与的疾病，所以单一的转基因小鼠模型不能完全模拟AD的病理生理特征。为了探讨APP与PS-1基因间的相互关系，Gordon等[14]构建了APP/PS-1双转基因小鼠模型，发现PS-1基因突变对突变型APP转基因小鼠在Aβ的沉积上有增强作用。PS-1基因促进过多表达APP基因的小鼠脑内大量Aβ42产生，使Aβ易于沉积在细胞外间质的SP内。这种模型能较好模拟Aβ发生过程，是目前常用的AD动物模型[9]。

有研究发现AD患者的SP内有高浓度铁离子存在，免疫组织化学染色也证实在AD患者的SP内有铁沉积[5]。铁离子等顺磁性物质在MRI的FSE序列T2WI下表现为点状低信号改变，所以使用磁共振，特别是高场强磁共振能够精确地探测脑内铁含量改变[6]。本实验主要使用3.0T MRI的FSE序列行T2WI 冠状扫描，表现为中晚期APP/PS1双转基因小鼠脑内皮层及海马区散在的点状低信号影，这与Jack等[7]的研究结果一致。APP/PS1双转基因小鼠的影像学表现与AD的相符。

3.2 miRNA-146a的炎症调节

miRNA通常被认为是细胞命运的决定因素，并且越来越多地被认为是各种脑部疾病的关键调节因子，从神经发育障碍到脑肿瘤，再到神经退行性疾病，使得miRNA成为治疗神经退行性疾病的一个非常有希望的靶点[15-16]。越来越多的研究[17]证明miRNA-146a参与调节人类神经变性疾病的炎症反应，miRNA-146a作为先天免疫反应的关键调节剂，在星状胶质细胞介导的炎症反应中起着重要作用。研究表明，miR-146a 的作用靶点包括补体因子H(CFH)、白细胞介素-1β(IL-1β)、白细胞介素-1受体相关激酶-1(IRAK-1)等，这些都与AD失调的先天免疫和炎症通路有关[18]。Lukiw等[19]研究发现，利用NF-κB敏感性的pre-miRNA146a转染星状胶质细胞，能上调miRNA146a的表达，同时下调CFH的表达，CFH作为免疫炎性反应的负调节因子，可通过抑制旁路途径(AP)而起到保护作用。miRNA-146a还可以作用于APP的金属蛋白酶10(ADAM10)的关键调节因子跨膜四旋TSPAN12，从而影响Aβ的代谢变化[20]。miRNA-146a的相关研究为临床治疗AD提供一定的理论基础，但尚未通过相应的临床试验证明，本研究从影像学角度证实了mRNA-146a干预后AD小鼠海马区Aβ沉积有一定程度的减少。

3.3 T2信号强度比值

T2信号强度比值可以作为一个半定量指标评价脑内病变的信号改变[8]。本研究的T2WI信号强度比值采用的是相对的T2WI信号强度，即相同ROI下的海马与同侧肌肉的T2WI信号强度比值。AD的发生发展过程中，铁等一些金属离子起到一定的作用，通过氧化应激反应，诱导神经元细胞凋亡。Jack等[7]的研究表明淀粉样斑块内有铁离子沉积。局部铁含量可以影响MRI的弛豫时间，使得相对T2WI信号强度比值减低。

本研究结果显示，与正常组相比，AD组的T2WI信号强度比值降低，两者间的差异有统计学意义(P<0.05或0.01)，提示AD组小鼠海马区铁沉积较正常组增多。经mRNA-146a干预治疗后，对比AD组的T2WI信号强度比值有所增高，两者间的差异有统计学意义(P<0.01)，提示干预组小鼠内铁沉积较AD组减少。

我们的研究结果发现，18月龄各组小鼠的T2WI信号强度比值比相对应的12月龄各组小鼠高，这与传统上认为越到晚期AD小鼠海马的铁沉积越多T2WI信号强度比值应该越低的观点不一致[21]。导致本研究结果的原因，有可能是由于晚期AD小鼠海马的胶质细胞增生较早中期更明显有关。有研究显示MRI信号增高与胶质细胞增生有关[22]。AD的主要病理改变是神经元减少，老年斑形成，以及海马神经元颗粒空泡变性和胶质细胞增生等，随着时间增长，老年性小鼠脑部的空泡变性和胶质细胞增生较早中期的小鼠明显。另外亦有相关研究提示神经细胞凋亡可导致T2WI信号强度比值的增高[21]，这也有可能是导致本研究这一结果的原因之一。

3.4 本研究的局限性

本研究的样本量偏少，结果的可靠性仍有待进一步证实。另本研究使用的临床型GE MR750对小鼠头部的SWAN和T2*扫描得到的图像质量不佳，可能与场强未能达到国外要求的7T或更高有关，且临床使用的均为大孔径磁共振，因此未能得到良好图像以评估、量化AD小鼠脑部的铁沉积状态。

总之，运用3.0T磁共振T2WI成像对APP/PS1双转基因小鼠的海马区的T2WI信号强度比值进行对比分析，有助于判断APP/PS1双转基因小鼠的成模情况及其在miRNA-146a干预治疗下的疗效，为临床AD患者的新型诊疗方案提供更多思路及理论支持。