郭千祥 梁幼玲 史旭华 白俊其 黄娟 黄志海 丘小惠

摘 要 目的：建立黑豆藥材的指纹图谱和5种异黄酮类成分的含量测定方法，为更好地控制该药材的质量提供参考。方法：采用高效液相色谱法（HPLC）建立指纹图谱并检测5种异黄酮类成分的含量。色谱柱为Phenomenex C18，流动相为乙腈-0.12%甲酸水溶液（梯度洗脱），流速为1 mL/min，检测波长为260 nm，柱温为30 ℃，进样量为10 ?L。以大豆苷为参照，绘制12批黑豆药材样品的HPLC指纹图谱，采用《中药特征指纹图谱相似度评价系统》（2012A版）进行相似度评价，确定共有峰;分别采用SPSS 20.0软件和SIMCA 13.0软件进行聚类分析和主成分分析。结果：12批黑豆药材样品共有19个共有峰，相似度均大于0.94;指认了5个成分，分别为大豆苷、黄豆黄苷、染料木苷、大豆苷元、染料木素。聚类分析结果显示，12批黑豆药材样品可聚为两类，即S1～ S3聚为一类，S4～S12聚为一类。主成分分析结果显示，2个主成分因子的方差贡献率分别为53.261%、40.715%，累积方差贡献率为93.976%。上述5种成分的质量浓度线性范围分别为5.97～191.00 ?g/mL（r=0.999 9）、1.05～33.46 ?g/mL（r=0.999 9）、8.93～285.61 ?g/mL（r=0.999 5）、0.82～26.33 ?g/mL（r=0.999 9）、0.93～29.64 ?g/mL（r=0.999 7）;定量限分别为0.881 1、0.611 6、0.078 6、0.243 3、0.511 6 ?g/mL，检测限分别为0.264 3、0.244 7、0.021 4、0.124 8、0.106 7 ?g/mL;精密度、稳定性、重复性、耐用性试验的RSD均小于5%;加样回收率为95.15%～96.56%（RSD=0.51%，n=6）、98.52%～103.45%（RSD=1.88%，n=6）、95.37%～97.91%（RSD=0.95%，n=6）、99.75%～102.00%（RSD=0.78%，n=6）、100.26%～103.65%（RSD=1.21%，n=6）。12批黑豆药材中上述5种成分的含量分别为0.178 3～0.265 9、0.021 7～0.096 2、0.288 5～0.597 2、0.014 1～0.058 8、0.012 9～0.082 9 mg/g。结论：所建指纹图谱和5种异黄酮类成分的含量测定方法均可用于黑豆药材的质量控制;不同产地黑豆药材中异黄酮类成分相似，但含量有所差异。

关键词 黑豆;异黄酮类;高效液相色谱法;指纹图谱;聚类分析;主成分分析;含量测定

ABSTRACT   OBJECTIVE： To establish the fingerprint of Sojae Semen Nigrum and content determination method of 5 kinds of isoflavones， so as to provide reference for controlling its quality better. METHODS： HPLC method was adopted to establish the fingerprint and detect the contents of 5 kinds of isoflavones. The determination was performed on Phenomenex C18 column with mobile phase consisted of acetonitrile-0.12% formic acid solution（gradient elution） at the flow rate of 1 mL/min. The detection wavelength was set at 260 nm; the column temperature was 30 ℃ and sample size was 10 μL. Using daidzin as reference， HPLC fingerprints of 12 batches of samples were determined. The similarity of 12 batches of samples was evaluated by TCM Chromatographic Fingerprint Similarity Evaluation System （2012A） to confirm common peak. Cluster analysis and principal component analysis were performed by using SPSS 20.0 software and SIMCA 13.0 software. RESULTS： There were 19 common peaks in HPLC fingerprints of 12 batches of samples，the similarity of which was higher than 0.94. Totally 5 components were identified， such as daidzin， glycitin， genistin， daidzein， genistein. Cluster analysis showed that 12 batches of Sojae Semen Nigrum were clustered into 2 categories， i.e. S1-S3 clustered into one category， and S4-S12 clustered into the other category. By principal component analysis， the contribution rates of two principle components were 53.261% and 40.715%; accumulative contribution rate was 93.976%. The linear range of above 5 components were 5.97-191.00 ?g/mL（r=0.999 9）， 1.05-33.46 ?g/mL（r=0.999 9）， 8.93-285.61 ?g/mL（r=0.999 5）， 0.82-26.33 ?g/mL（r=0.999 9）， 0.93-29.64 ?g/mL （r=0.999 7）， respectively. The limits of quantitation were 0.881 1， 0.611 6， 0.078 6， 0.243 3， 0.511 6 μg/mL， respectively. The limits of detection were 0.264 3， 0.244 7， 0.021 4， 0.124 8， 0.106 7 μg/mL， respectively. RSDs of precision， stability， reproducibility and durability tests were all lower than 5%. Recoveries were 95.15%-96.56%（RSD=0.51%，n=6）， 98.52%-103.45%（RSD=1.88%，n=6）， 95.37%-97.91% （RSD=0.95%， n=6）， 99.75%-102.00% （RSD=0.78%， n=6）， 100.26%-103.65% （RSD=1.21%， n=6）. Among 12 batches of Sojae Semen Nigrum， the contents of above 5 components were 0.178 3-0.265 9，0.021 7-0.096 2， 0.288 5-0.597 2， 0.014 1- 0.058 8，0.012 9-0.082 9 mg/g. CONCLUSIONS： Established HPLC fingerprint and content determination method of 5 kinds of isoflavones can be used for quality control of Sojea Semen Nigrum. The Isoflavone components are similar， but the contents are different among Sojae Semen Nigrum from different producing areas.

KEYWORDS   Sojae Semen Nigrum; Isoflavones; HPLC; Fingerprint; Cluster analysis; Principal component analysis; Content determination

黑豆为豆科植物大豆[Glycine max（L.）Merr.]的干燥成熟种子[1]。《本草纲目》中记载，大豆有黑、白、黄、褐、青、斑数色，黑者入药[2]。中医认为，五色入五脏，黑色属水，水走肾，黑豆专入肾经，故被认定为“补肾”之品[3]。2015年版《中国药典》（一部）收录黑豆，载其有益精明目、养血祛风、利水、解毒等功效[1]。现代药理研究表明，黑豆具有抗氧化、调节激素水平、预防动脉血管硬化、延年益智、防癌抗癌等作用[4]。该药的作用机制与其所含多种生物活性成分有关，尤以异黄酮最为突出。该类成分除具有缓解更年期综合征、防治骨质疏松及心血管疾病等作用外，还具有显著的防癌抗癌作用，故备受学者关注[5]。

化学成分是中药药效发挥作用的物质基础，中药质量与其复杂的有效成分密切相关，因此采用指纹图谱结合多指标成分的含量测定可更好地控制中药质量[6]。黑豆为2010年版《中国药典》（一部）新收录的品种，现行标准收载于2015年版《中国药典》（一部），包括性状鉴别、显微鉴别和薄层色谱鉴别等[1]，尚无含量测定项。虽然，陆泉[7]采用反相高效液相色谱法测定黑豆中大豆苷的含量;刘洋等[8]研究发现，不同产地黑豆黄酮提取物的抗氧化还原能力不同，其中产地影响较大，因此认为不同产地黑豆的药效也存在一定差异。但这些研究的指标单一，存在一定的局限性，且关于黑豆的指纹图谱、不同产地质量差异的研究较少。本课题组通过前期化学成分和药理研究证实，黑豆中含有大豆苷、黄豆黄苷、染料木苷、大豆苷元和染料木素等5种异黄酮成分，这5种成分也是其发挥药理作用的活性成分[9]。为更加全面地评价黑豆质量，本研究采用高效液相色谱法（HPLC）建立了12批黑豆药材样品的HPLC指纹图谱，测定了上述5种异黄酮类成分的含量，同时结合聚类分析和主成分分析（PCA）进行综合质量评价，旨在为其质量标准的完善提供参考。

1 材料

1.1 仪器

1200型HPLC仪，包括G1322A型在线真空脱气机、G1311A型四元泵、G1329A型自动进样器、G1316A型柱温箱、G1315D型二极管阵列检测器、1200 Series色谱工作站B04.01版（美国Agilent公司）;Milli-Q Advantage A10型纯水机（美国Millipore公司）;BT-125D型十万分之一电子天平[赛多利斯科学仪器（北京）有限公司];LK/CSJ-20型超声波清洗机（成都老肯科技股份有限公司）。

1.2 试剂

大豆苷元对照品（批号：JL22382，纯度：≥98%）、染料木素对照品（批号：MB2170，纯度：≥98%）均购自广州菲博生物科技有限公司;大豆苷对照品（批号：111738-201603，纯度：≥93.3%）、染料木苷对照品（批号：111709-201702，纯度：99.9%）均购自中国食品药品检定研究院;黄豆黄苷对照品（批号：J04044AS，纯度：≥98%）购自大连美仑生物技术有限公司;甲酸、乙腈为色谱纯，甲醇为分析纯，水为超纯水。

1.3 药材

12批黑豆药材样品（编号：S1～S12）均由康美药业股份有限公司提供，经广州中医药大学第二临床医学院黄志海主任中药师鉴定为豆科植物大豆[G. max（L.）Merr.]的干燥成熟种子。黑豆药材样品信息来源见表1。

2 方法与结果

2.1 指纹图谱的建立

2.1.1 混合对照品溶液的制备 分别取大豆苷、大豆苷元、黄豆黄苷、染料木素、染料木苷对照品各4 mg，精密称定，置于10 mL棕色量瓶中，加70%甲醇制成质量浓度均为0.4 mg/mL的单一对照品溶液。取各单一对照品溶液适量，置于10 mL棕色量瓶中，加70%甲醇定容，摇匀，即得上述5种成分质量浓度均为4 μg/mL的混合对照品溶液。

2.1.2 供试品溶液的制备 取黑豆药材样品粉末（过80目筛）2 g，精密称定，置于20 mL棕色量瓶中，加70%甲醇20 mL，超声（功率：250 W，频率：40 kHz）提取30 min，经0.45 ?m微孔滤膜滤过，取续滤液，即得供试品溶液。

2.1.3 色谱条件 色谱柱：Phenomenex C18（250 mm×4.60 mm，5 μm）;流动相：乙腈（A）-0.12%甲酸水溶液（B），梯度洗脱（洗脱程序見表2）;流速：1 mL/min;检测波长：260 nm;柱温：30 ℃;进样量：10 ?L。

2.1.4 精密度试验 取“2.1.2”项下供试品溶液（编号：S8）适量，按“2.1.3”项下色谱条件连续进样测定6次，以大豆苷的保留时间和峰面积为参照，记录各共有峰的相对保留时间和相对峰面积。结果，19个共有峰相对保留时间的RSD均小于1%（n=6），相对峰面积的RSD均小于5%（n=6），表明本方法精密度良好。

2.1.5 稳定性试验 取“2.1.2”项下供试品溶液（编号：S8）适量，分别于室温避光放置0、2、4、6、8、10、12 h时按“2.1.3”项下色谱条件进样测定，以大豆苷的保留时间和峰面积为参照，记录各共有峰的相对保留时间和相对峰面积。结果，19个共有峰相对保留时间的RSD均小于1%（n=7），相对峰面积的RSD均小于5%（n=7），表明供试品溶液于室温下放置12 h内稳定性良好。

2.1.6 重复性试验 取黑豆药材样品（编号：S8）粉末2 g，共6份，按“2.1.2”项下方法制备供试品溶液，再按“2.1.3”项下色谱条件进样测定，以大豆苷的保留时间和峰面积为参照，记录各共有峰的相对保留时间和相对峰面积。结果，19个共有峰相对保留时间的RSD均小于1%（n=6），相对峰面积的RSD均小于5%（n=6），表明本方法重复性良好。

2.1.7 HPLC指纹图谱的生成 取12批黑豆药材样品适量，按“2.1.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.1.3”项下色谱条件进样测定，采用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》（2012A版）进行分析，得HPLC指纹图谱，详见图1、图2。

2.1.8 相似度评价 采用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》（2012A版），以黑豆药材样品的HPLC对照指纹图谱为对照，进行整体相似度评价。结果显示，12批黑豆药材样品的相似度均大于0.94，提示黑豆药材样品的化学成分一致性较好，详见表3。

2.1.9 共有峰的指认 12批黑豆药材样品共有19个共有峰，通过与混合对照品溶液的HPLC图（见图3A）比对，指认11号峰为大豆苷。因该峰分离度良好、峰面积大且稳定，故以其保留时间和峰面积为参照，计算其他峰的相对保留时间和相对峰面积，结果见表4、表5。

2.2 聚类分析

以各共有峰的峰面积为变量，得到19×12阶数据矩阵，采用SPSS 20.0软件以离差平方和法（即Ward法）对12批黑豆药材样品进行聚类分析，详见图4。由图4可知，12批黑豆药材样品可聚为两大类：S4～S12聚为一类，S1～S3聚为一类。

2.3 PCA分析

采用SIMCA 13.0 软件进行PCA分析，结果见图5。由图5可知，S4～S12在PCA得分图的左侧，S1～S3在PCA得分图的右侧，该结果与聚类分析结果一致。

对12批黑豆药材样品的19个共有峰的峰面积进行标准化处理后，采用SPSS 20.0软件进行PCA分析，计算主成分因子的特征值、方差贡献率等，结果见表6。由表6可知，共得到2个主成分因子，方差贡献率分别为53.261%、40.715%，累积方差贡献率为93.976%，提示主成分因子1、2可作为黑豆药材的评价指标，适用于PCA分析。故以主成分因子1、2为指标对12批黑豆药材样品进行整体质量评价，结果见表7。由表7可知，S4～S12药材样品质量相近，与S1～S3药材样品质量存在较大差异。

2.4 含量测定

2.4.1 溶液的制备 混合对照品溶液的制备同“2.1.1”项;供试品溶液的制备同“2.1.2”项;以70%甲醇为阴性对照溶液。

2.4.2 色谱条件 同“2.1.3”项。

2.4.3 系统适用性试验 取“2.4.1”项下混合对照品溶液（70%甲醇稀释）、供试品溶液（编号：S8）、阴性对照溶液适量，按“2.4.2”项下色谱条件进样测定，记录色谱图，详见图3。由图3可知，供试品与混合对照品中各待测成分色谱峰的保留时间基本一致，且各成分在对应的位置无干扰，均在25 min内出峰完毕，分离度均大于1.5，理论板数以大豆苷峰计大于10 000，阴性对照无干扰。

2.4.4 线性关系考察 分别精密吸取“2.1.1”项下大豆苷、黄豆黄苷、大豆苷元、染料木素单一对照品溶液955、167.30、131.65、148.20 ?L，置于2 mL棕色量瓶中;另取染料木苷单一对照品溶液1 428.05 ?L，置于2 mL棕色量瓶中;均分别加70%甲醇定容，摇匀，得大豆苷、黄豆黄苷、大豆苷元、染料木素质量浓度分别为191.00、33.46、26.33、29.64 ?g/mL的混合对照品溶液以及染料木苷质量浓度为285.61 ?g/mL的单一对照品溶液。另取上述4种混合对照品溶液及染料木苷单一对照品溶液，用70%甲醇逐级稀释2、4、8、16、32倍，得系列线性关系工作溶液，按“2.4.2”項下色谱条件进样测定，记录峰面积。以各待测成分质量浓度（x，?g/L）为横坐标、峰面积（y）为纵坐标进行线性回归，结果见表8。

2.4.5 定量限与检测限考察 精密量取“2.4.4”项下大豆苷、黄豆黄苷、大豆苷元、染料木素混合对照品溶液和染料木苷单一对照品溶液适量，用70%甲醇倍比稀释，按“2.4.2”项下色谱条件进样测定，以信噪比10 ∶ 1、3 ∶ 1分别计算定量限、检测限，结果见表8。

2.4.6 精密度试验 精密量取“2.4.4”项下大豆苷、黄豆黄苷、大豆苷元、染料木素混合对照品溶液和染料木苷单一对照品溶液适量，按“2.4.2”项下色谱条件连续进样测定6 次，记录峰面积。结果，大豆苷、黄豆黄苷、染料木苷、大豆苷元、染料木素峰面积的RSD分别为1.33%、1.31%、1.33%、1.36%、1.34%（n=6），表明仪器精密度良好。

2.4.7 稳定性试验 取“2.4.1”项下供试品溶液（编号：S8），分别于室温放置0、2、4、6、8、10、12 h时按“2.4.2”项下色谱条件进样测定，记录峰面积。结果，大豆苷、黄豆黄苷、染料木苷、大豆苷元、染料木素峰面积的RSD分别为2.66%、2.47%、2.48%、2.90%、1.20%（n=7），表明供试品在室温下放置12 h内稳定性良好。

2.4.8 重复性试验 取黑豆药材样品粉末（编号：S8）共6份，每份约1 g，按“2.4.1”项下方法制备供试品溶液，再按“2.4.2”项下色谱条件进样测定，记录峰面积并按标准曲线法计算样品中5种成分的含量。结果，大豆苷、黄豆黄苷、染料木苷、大豆苷元、染料木素的平均含量分别为0.212 4、0.040 6、0.330 7、0.040 1、0.038 4 mg/g，RSD分别为0.67%、0.87%、0.78%、1.13%、1.82%（n=6），表明方法重复性良好。

2.4.9  加样回收率试验   精密称取已知含量的黑豆药材样品粉末（编号：S8），共6份，每份约1 g，精密称定，加入适量“2.1.1”项下各单一对照品溶液，按“2.4.1”项下方法制备供试品溶液，再按“2.4.2”项下色谱条件进样测定，记录峰面积并计算加样回收率，结果见表9。

2.4.10 耐用性试验 取黑豆药材样品粉末（编号：S8）适量，按“2.4.1”项下方法制备供试品溶液，再参照“2.4.2”项下色谱条件[调整流动相（B）不同含酸量（0.7%、0.12%、0.17%）、不同流速（0.9、1.0、1.1 mL/min）、不同柱温（20、25、30 ℃）]进样测定，记录峰面积并按标准曲线法计算样品中5个成分的含量，结果见表10。结果表明，该方法能够满足试验要求，耐用性良好。

2.4.11 样品含量测定 取12批黑豆药材样品适量，按“2.4.1”项下方法制备供试品溶液，再按“2.4.2”项下色谱条件进样测定，平行操作3次，记录峰面积并按标准曲线法计算样品中5种成分的含量，结果见表11。

3 讨论

在前期预试验中，笔者分别考察了30%、50%、70%、90%甲醇为提取溶剂时的提取效果，发现以70%甲醇提取时，各待测成分的色谱峰响应相对最高，故选择70%甲醇为提取溶剂。笔者又比较了不同检测波长（210、254、260、280、360 nm）下各色谱峰的分离效果，发现当检测波长为260 nm时，各色谱峰均有较强吸收，且分离度较好，故选择检测波长为260 nm。同时，笔者还考察了乙腈-0.10%冰乙酸水溶液、乙腈-0.12%甲酸水溶液不同流动相系统的分离效果，发现以乙腈-0.12%甲酸水溶液为流动相进行梯度洗脱时，各色谱峰分离度较好，故选择流动相为乙腈-0.12%甲酸水溶液进行梯度洗脱。

指纹图谱能体现中药成分的整体性，符合中药质量评价的特点[10]，但无法确定指纹图谱中各共有峰所代表的物质及其含量，因此在指纹图谱的基础上进行多成分定量分析，可在一定程度上弥补上述不足[11]。相似度评价结果显示，12批黑豆药材样品的相似度均大于0.94，表明各批黑豆药材样品的化学成分一致性较好;共获得19个共有峰，相对保留时间的RSD为0～0.53%，相对峰面积的RSD为0～62.50%，表明不同产地黑豆药材样品间虽然具有相同的化学成分，但含量存在差异。聚类分析、PCA分析结果均显示，12批黑豆药材样品可聚为两类：S4～S12聚为一类，S1～S3聚为一类;S4～S12药材样品质量相近，与S1～S3存在较大差异。含量测定结果显示，同一省份产地黑豆药材样品中大豆苷、黄豆黄苷、染料木苷、大豆苷元、染料木素含量无显著差异，但不同省份产地黑豆药材样品间含量差异明显，这可能与其产地的地理位置、气候、土壤等因素可影响黑豆的次生代谢产物有关（因黑豆的次生代谢产物中也含有黄酮类成分）[12]。

综上所述，本文所建指纹图谱和5种异黄酮类成分的含量测定方法均可用于黑豆药材的质量控制;不同产地黑豆药材中异黄酮类成分相似，但含量有所差异。

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（收稿日期：2019-08-19 修回日期：2020-01-03）

（编辑：陈 宏）