黄小珊 蓝凰齐 唐汉庆 张世田 庞路路

摘 要 目的：观察壮通饮水提物对心肌缺血再灌注模型大鼠血液流变学和血脂水平的影响，初步探讨该方减少缺血再灌注后心律失常发生的分子生物学基础。方法：取SD大鼠75只，随机分为对照组、模型组和壮通饮水提物低、中、高剂量组（6.8、13.6、27.2 g/kg），每组15只。通过结扎左心室回旋支末梢致缺血30 min和再灌注60 min，建立大鼠心肌缺血再灌注模型。术后第1天起，对照组、模型组大鼠均灌胃等体积水，壮通饮水提物各剂量组大鼠灌胃相应药液，每日1次，连续28 d。分别在术后第7、14、21、28天检测大鼠心律失常发生情况并计算发生率。给药结束后，检测大鼠血液流变学指标和血清总胆固醇（TC）、三酰甘油（TG）、低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）、高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）含量;采用苏木精-伊红染色法观察大鼠心肌组织形态学;采用Western blotting法检测大鼠心肌组织中凋亡相关因子FAS和FAS配体（FAS-L）的蛋白表達。结果：与对照组比较，模型组大鼠心律失常发生率显著升高，全血比黏度、血细胞比容（HCT）、体外形成血栓长度和质量、血小板凝聚率、红细胞滤过指数（IF）以及血清TC、TG、LDL-C含量均显著增加或升高，体内血栓的形成时间显著缩短，血清HDL-C含量显著降低，心肌组织中FAS和FAS-L蛋白相对表达量均显著升高（P<0.05或P<0.01）;大鼠心肌组织形态学呈明显病理改变。与模型组比较，壮通饮水提物各剂量组大鼠心律失常发生率呈明显下降趋势;除壮通饮水提物低剂量组大鼠的HCT降低不具有统计学意义（P>0.05）外，其余给药组大鼠的全血比黏度、HCT、体外形成血栓的长度和质量、血小板凝聚率、IF值以及血清TC、TG、LDL-C含量均显著减少或降低，体内血栓的形成时间均显著延长，血清HDL-C含量均显著升高，心肌细胞中FAS和FAS-L蛋白相对表达量均显著降低（P<0.05或P<0.01）;大鼠心肌组织病理变化明显改善。结论：壮通饮可通过其活血化瘀作用改善心肌缺血再灌注模型大鼠的血液流变学指标，降低血清中TC、TG、LDL-C含量，提高HDL-C含量，并下调FAS和FAS-L蛋白表达，从而发挥抑制心肌细胞凋亡的作用，减少心律失常的发生。

关键词 壮通饮;心肌缺血再灌注;血液流变学;血脂;凋亡相关因子;冠心病;心律失常;大鼠

ABSTRACT   OBJECTIVE： To investigate the effects of Zhuangtongyin water extract （ZTYWE） on hemorheology and blood lipid level of myocardial ischemia-reperfusion model rats， and preliminarily explore its molecular biology foundation of reducing arrhythmia after myocardial ischemia-reperfusion. METHODS： Totally 75 SD rats were divided into control group， model group and ZTYWE low-dose， middle-dose and high-dose groups. Myocardial ischemia-reperfusion model was established by ligating the left ventricle cyclotron endings for 30 min then reperfusing for 60 min. Since the first day after surgery， control group and model group were intraperitoneally administrated with same volume normal saline; ZTYWE low-dose， middle-dose and high-dose groups were intraperitoneally administrated with medicine solution （6.8， 13.6， 27.2 g/kg）， once a day， for continuous 28 d. At the 7th， 14th， 21st， 28th day after surgery， the incidence rate of arrhythmia of rats were detected. The hemorheology indicators and serum contents of TC， TG， LDL-C， HDL-C were determined after the last administration. The morphology of myocardial tissue was observed by HE staining. The protein expressions of apoptosis-related factor FAS and FAS-L were detected by Western blotting assay. RESULTS： Compared with control group， the incidence rates of arrhythmia of rats in model group were significantly increased; the whole blood contrast viscosity， hematocrit （HCT）， in vitro forming length and quality of thrombosis， platelet aggregation rate， erythrocyte filtration index （IF）， as well as the serum contents of TC， TG and LDL-C were significantly increased; in vivo thrombus formation time as well as the serum content of HDL-C were significantly decreased; the protein expression of FAS and FAS-L were significantly increased （P<0.05 or P<0.01）; obvious pathological changes were observed in myocardial tissue. Compared with model group， the incidence rates of arrhythmia of rats in ZTYWE groups were in obvious reducing trend; except for the HCT in low-dose ZTYWE group without significance， the blood contrast viscosity， HCT， in vitro forming length and quality of thrombosis， platelet aggregation rate， IF as well as the serum contents of TC， TG and LDL-C were significantly decreased; in vivo thrombus formation time as well as the serum contents of HDL-C were significantly increased; the protein expressions of FAS and FAS-L were significantly decreased （P<0.05 or P<0.01）; the pathological changes of myocardial tissue were improved. CONCLUSIONS： Through the promoting blood circulation and removing blood stasis effect， Zhuangtongyin decoction can improve indexes of hemorheology index of ischemia-reperfusion model rats， reduce the contents of TC， TG and LDL-C， enhace the contents of HDL-C， down-regulate the protein expression of FAS and FAS-L， so as to inhibit myocardial cells apoptosis and reduce arrhythmia.

KEYWORDS   Zhuangtongyin decoction; Myocardial ischemia-reperfusion; Hemorheology; Blood lipid; Apoptosis-related factor; Coronary heart disease;Arrhythmia; Rats

冠状动脉梗塞后会发生心肌缺血，而恢复血液灌流后却发现会继发系列损伤，即心肌缺血再灌注损伤（如心律失常等），而心律失常是导致患者死亡的常见原因[1]。冠状动脉粥样硬化是冠状动脉梗塞的主要原因，研究表明，高脂血症是冠状动脉粥样硬化的危险因素，降脂治疗可以显著降低冠状动脉粥样硬化的风险[2]。此外，由于冠状动脉粥样硬化使管腔变窄、血流量减少、血流变慢而使血液处于高凝状态、流动性变差，故存在形成微血栓、加重心律失常发生的危险[3]。因此，防止冠状动脉粥样硬化并使血液流变学参数恢复正常从而减少再灌注后心律失常，对于冠心病的治疗具有重要的临床意义。

壮通饮是广西壮族民间常用的经验方，由扶芳藤、参三七、黄花倒水莲等3味广西特色壮药材配伍而成，具有活血化瘀之效[4]。该方临床用于治疗高脂血症、脑梗死、心肌梗死等心脑血管疾病具有较好的效果[5-7]，但针对其通过活血化瘀作用治疗心脑血管疾病方面的分子生物学机制研究尚不多见。为此，本课题组基于前期研究，通过建立心肌缺血再灌注大鼠模型，观察壮通饮水提物对模型大鼠血液流变学和脂质代谢的影响，并初步探讨其通过活血化瘀作用减少冠心病心律失常发生的分子生物学基础，为其临床应用提供实验基础，进而推动壮族医药经验方的开发与应用。

1 材料

1.1 仪器

MR-4型微电脑血栓检测仪（郑州绿康科技生物发展有限公司）;ZS9200型血流变测试仪（北京众驰伟业科技发展有限公司）;V-100型小动物呼吸机（上海玉研科学仪器有限公司）;AU-2700型全自动生化分析仪、IX51型倒置显微镜（日本Olympus公司）;AE160型电子天平（瑞士Mettler Toledo公司）;077526型心电图机（上海光电医用电子仪器有限公司）;PowerPac HC型电泳仪（美国Bio Rad公司）;RM2245型切片机（上海莱卡显微系统有限公司）;PK121R型离心机（美国ALC公司）;1500M型生物医学凝胶成像系统（美国DVC公司）。

1.2 药品与试剂

注射用青霉素钠（华北制药股份有限公司，批号：D0801320，规格：80万单位/瓶）;总胆固醇（TC）、三酰甘油（TG）、低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）、高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）试剂盒（南京建成生物工程研究所，批號：20180235、20180225、20180236、20180237）;凋亡相关因子FAS和FAS配体（FAS-L）Western blotting蛋白表达检测试剂盒、蛋白裂解液、β-actin（内参，北京索莱宝科技有限公司，批号：20180420、20180422、2181466、2180892）;苏木精、伊红染色试剂（上海蓝季科技发展有限公司，批号：A10034、A10022）;0.9%氯化钠注射液（四川科伦药业股份有限公司，批号：H20056626;作生理盐水使用）;其余试剂均为分析纯，水为蒸馏水。

1.3 药材

扶芳藤饮片（广西仁济堂中药饮片有限公司，批号：151101）;参三七饮片（江西樟树天齐堂有限公司，批号：20131023）;黄花倒水莲饮片（广西张益堂中药饮片有限公司，批号：1602092）。上述药材饮片经右江民族医学院基础医学院李克明副教授鉴定分别为卫矛科植物扶芳藤[Euongmus fortunei（Turez）Hand-Mazz]的茎叶、五加科植物参三七[Panax notoginseng （Burk）F. H. Chen]的干燥根、远志科植物黄花倒水莲[Polygala aureocauda Dunn]的根。

1.4 动物

SPF级SD大鼠75只，雌雄各半，9～10周龄，体质量180～205 g，由右江民族医学院实验动物中心提供，动物使用许可证号：SYXK桂2017-0004。所有大鼠均分笼常规饲养。

2 方法

2.1 壮通饮水提物的制备

取扶芳藤、参三七、黄花倒水莲饮片，粉碎，过50目筛，按质量比6 ∶ 3 ∶ 4混合，用10倍量水（g/mL）煎煮，滤过，滤液置于水浴锅中蒸干，得壮通饮水提物浸膏（每100克药材得浸膏60 g）。临用前，取水提物浸膏，以水溶解，制得质量浓度为2.72 g/mL（按浸膏质量计）的溶液，备用。

2.2 动物分组、造模与给药

取大鼠75只，按随机数字表法分为对照组、模型组和壮通饮水提物低、中、高剂量组，每组15只。参考本课题组前期研究结果[4]造模：除对照组不作任何处理外，其余组大鼠均腹腔注射10%水合氯醛（3.5 mL/kg）麻醉，使用小动物呼吸机机械通气并行心电监护;经左侧开胸，暴露心脏，结扎左心室回旋支末梢，直至观察到结扎下方心肌颜色逐渐变灰白（缺血区）及心电图出现S-T段抬高0.2 mm或者出现增高、增宽的QRS波后，用生理盐水浸湿的纱布覆盖于伤口处;缺血30 min后剪开结扎线，观察直至心脏颜色由灰白逐渐变成正常、心电图S-T段下降，则视为再灌注开始;再灌注60 min后，缝合切口，置于笼中饲养。于所有大鼠的大腿处肌内注射青霉素钠80万单位（每日1次，连续3 d）以预防感染。术后第1天起，对照组、模型组大鼠均灌胃等体积水，壮通饮水提物低、中、高剂量组大鼠分别按体质量以6.8、13.6、27.2 g/kg（以浸膏质量计，剂量参考文献[8]设置）灌胃给药，每日1次，连续28 d。

2.3 大鼠心律失常情况观察

分别在术后第7、14、21、28天时使用心电图机记录大鼠心律失常发生情况，并计算发生率。

2.4 大鼠血液流变学指标检测

于末次给药后4 h开始，分离大鼠颈动脉并放置刺激电极和记录电极，采用血栓检测仪测定体内血栓的形成时间;测定完毕后，于其腹主动脉采血，采用血流变测试仪测定其全血比黏度（低切变率、高低变率）、血细胞比容（HCT）、体内血栓形成时间、体外形成血栓长度和质量、血小板聚集率、红细胞滤过指数（IF）。

2.5 大鼠血清血脂指标含量检测

按“2.4”项下时间点于大鼠腹主动脉采血，以4 000 r/min离心10 min后取血清。采用全自动生化分析仪以分光光度法检测TC、TG、LDL-C、HDL-C含量。严格按相应试剂盒说明书操作。

2.6 大鼠心肌组织形态学变化观察

按“2.4”项下时间点于大鼠腹主动脉采血后，取大鼠左心室心尖部分组织，以生理盐水洗净，于4%多聚甲醛溶液中固定24 h;常规梯度乙醇脱水、二甲苯透明、石蜡包埋、切片（厚度5 μm），常规脱蜡复水后，进行苏木精-伊红（HE）染色;梯度乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封片，置于显微镜下观察心肌组织形态学变化并拍照。

2.7 大鼠心肌组织中FAS和FAS-L蛋白相对表达量检测

采用Western blotting 法进行检测。按“2.6”项下时间点取大鼠左心室心尖部分组织，加入5倍体积（g/mL）的裂解液冰浴裂解30 min;4 ℃下以12 000 r/min离心20 min，取上清液，经蛋白定量、变性、聚丙烯酰氨凝胶电泳、转膜、封闭后加入FAS、FAS-L、β-actin一抗（1 ∶ 600），4 ℃孵育过夜;再加入二抗（1 ∶ 2 000），室温下孵育1 h，增强化学发光法显影;采用凝胶系统拍摄图像。采用Image J 1.48图像分析软件分析所得蛋白条带的灰度值（条带面积×条带密度），并以β-actin 为内参对照，计算各目标蛋白灰度值与β-actin条带灰度值的比值，用以表示目标蛋白的相对表达量。

2.8 统计学方法

采用SPSS 22.0软件对数据进行统计分析。计数资料以率（%）表示，两组间比较采用卡方检验。计量资料以x±s表示，多组间比较采用单因素方差分析;对差异有统计学意义的再采用Bartlett检验进行两组间方差齐性检验，若方差齐则采用LSD-t检验进行组间两两比较，若方差不齐则采用非参数秩和检验。P<0.05为差异有统计学意义。

3 结果

3.1 各组大鼠心律失常情况

与对照组比较，模型组大鼠術后第7、14、21、28天时心律失常发生率均显著升高，分别为87%、87%、80%、73%（P<0.01）。与模型组比较，壮通饮水提物中、高剂量组大鼠在术后第14、21、28天时心律失常发生率均显著降低（P<0.05或P<0.01），详见表1。

3.2 大鼠血液流变学指标检测结果

3.2.1 全血比黏度和HCT 与对照组比较，模型组大鼠全血比黏度、HCT均显著升高（P<0.01或P<0.05）。与模型组比较，除壮通饮水提物低剂量组大鼠HCT的降低不具有统计学意义外（P>0.05），壮通饮水提物其余各剂量组的上述指标均显著降低（P<0.01或P<0.05），且与对照组指标水平较为接近，详见表2。

3.2.2 其他血液流变学指标 与对照组比较，模型组大鼠体内血栓的形成时间显著缩短，体外形成血栓长度和质量、血小板凝聚率、IF值均显著增加或升高（P<0.05或P<0.01）。与模型组比较，壮通饮水提物各剂量组大鼠体内血栓的形成时间均显著延长，而体外形成血栓长度和质量、血小板凝聚率、IF值均显著减少或降低（P<0.05或P<0.01），详见表3。

3.3 大鼠血清血脂指标检测结果

与对照组比较，模型组大鼠血清TC、TG、LDL-C含量均显著升高，HDL-C含量显著降低（P<0.05或P<0.01）。与模型组比较，壮通饮水提物各剂量组大鼠血清中TC、TG、LDL-C含量均显著降低，HDL-C含量均显著升高（P<0.05或P<0.01），详见表4。

3.4 大鼠心肌组织形态学变化

对照组大鼠心肌纤维境界清楚、排列规则、轮廓分明、染色均匀，未见渗液或炎症细胞浸润;模型组大鼠心肌纤维排列紊乱、境界不清有断裂、染色深浅不均，局部有溶解坏死现象;与模型组比较，壮通饮水提物各剂量组大鼠心肌纤维排列紊乱、溶解坏死等现象均有不同程度的减轻，详见图1。

3.5 大鼠心肌组织中FAS和FAS-L蛋白相对表达量检测结果

与对照组比较，模型组大鼠心肌组织中FAS和FAS-L蛋白的相对表达量均显著升高（P<0.01）;与模型组比较，壮通饮水提物各剂量组大鼠心肌组织中上述蛋白的相对表达量均显著降低（P<0.05或P<0.01），详见图2、表5。

4 讨论

心肌缺血再灌注后会出现心肌细胞凋亡、微动脉损伤及心律失常等系列损伤，其中心律失常较为常见，且为患者主要致死原因之一[9]，因此有必要对再灌注后心律失常的发生机制进行更深入的研究。对于心肌缺血再灌注后心律失常的发生，有报道认为与高脂血症密切相关[10]。高脂血症可诱导心肌重构和心律失常，而通过药物干预降低血脂水平、减少心肌细胞凋亡和心肌重构从而抑制心律失常的发生是治疗心肌缺血再灌注后心律失常的有效途径[11]。还有研究表明，高脂血症可导致心肌细胞凋亡、加重心肌缺血再灌注损伤[12];高脂饮食诱导的心肌细胞过度凋亡易引起心律失常[13]，而通过降低血脂水平、减轻血液高黏状态、下调凋亡相关因子FAS和FAS-L表达水平可减缓心肌细胞凋亡并减少心律失常的发生[14-15]。

血清中LDL-C、HDL-C、TC、TG含量是主要的血脂水平指标。研究证实，LDL-C含量越高，脂类沉淀速度越快，泡沫细胞形成越多，越容易诱发动脉硬化，导致心肌缺血[16];TC、TG有促进动脉粥样硬化发生的作用[17-18]，而HDL-C具有抗动脉粥样硬化的作用[19]。因此，降脂治疗已成为抗动脉粥样硬化、减少心肌缺血及心肌缺血再灌注后心律失常发生的重要方法。另一方面，动脉粥样硬化使管腔变得狭窄、血流量减少、血流缓慢、血液处于高凝状态，而具有活血化瘀功效的中药可通过改善冠心病血液高黏度及高凝聚病理状态，从而恢复血液正常生理特性以及降低血脂水平[3]。

本研究结果显示，与对照组比较，模型组大鼠心肌缺血再灌注后心律失常的发生率显著升高，但随时间的延长呈降低趋势，推测可能是部分大鼠机体自身存在的调节机制反应比较灵敏，从而能不同程度地消除心律失常影响所致。采用壮通饮水提物对心肌缺血再灌注模型大鼠进行干预后，中、低剂量组大鼠心律失常发生率（术后第14、21、28天）呈明显下降趋势;除壮通饮水提物低剂量组大鼠的HCT降低不具有统计学意义外，其余各剂量组的全血比黏度、HCT、体外形成血栓的长度和质量、血小板凝聚率、IF值均显著减少或降低，体内血栓的形成时间均显著延长;血清TC、TG、LDL-C含量均显著降低，而HDL-C含量显著升高;心肌组织形态学观察结果显示，其心肌纤维病理变化得到明显改善。FAS和FAS-L是介导细胞凋亡的重要因子，两者蛋白表达的上调可早期启动凋亡进程并诱导下游凋亡蛋白活化，从而促进细胞凋亡[20]。本研究结果显示，采用壮通饮水提物对心肌缺血再灌注模型大鼠进行干预后，大鼠心肌组织中的FAS和FAS-L蛋白表达水平均显著降低。这提示壮通饮一方面可改善血液“黏、浓、凝、聚”的病理变化，表现出“活血”作用;另一方面可降低血脂水平，表现出“化瘀”作用，进而发挥减少细胞凋亡和心律失常发生的作用。

综上，壮通饮水提物能明显减少心肌缺血再灌注模型大鼠的心律失常情况;該方可通过其活血化瘀作用改善大鼠血液流变学指标，降低大鼠血清中TC、TG、LDL-C含量，提高HDL-C含量，并下调FAS和FAS-L蛋白表达，从而发挥抑制心肌细胞凋亡的作用。

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（收稿日期：2019-07-24 修回日期：2019-12-29）

（编辑：段思怡）