廖晓容 黄慧

寻常型银屑病(psoriasis vulgaris，PV)又称为牛皮癣，为临床一种常见的皮肤病，易复发。进行期、静止期和退行期为PV的3个时期[1]。约粟粒至绿豆大小的红色炎性丘疹为该病首先表现，棕红色斑块为融合扩大逐渐形成，清楚边界，炎性红晕周围，明显浸润基底及多层干燥的银白色或灰白色鳞屑覆盖表面为PV之后的临床表现。银屑病三联征为临床诊断该病的主要特征，分别为点状出血、白色鳞屑和发亮薄膜。点状出血现象为薄膜刮除，小出血点出现；薄膜现象为表面鳞屑被轻轻刮除，一层淡红色发亮的半透明薄膜逐渐露出[2-4]。目前，PV的病因和发病机制尚未完全阐明和明确，且被活化的效应性T细胞功能紊乱发生机制也未明确。CD4+T细胞的2个新亚型为Treg细胞，即CD4+CD25+调节性T细胞为近年来研究的重要课题，Th17细胞也被越来越多研究报道。诸多研究报道，自身免疫性疾病多与Treg细胞和Th17细胞息息相关，但关于PV患者外周血中Th17 细胞、Foxp3+Treg 细胞及Treg细胞的表达水平的研究报道较少[5，6]。本研究主要采用流氏细胞仪直接免疫荧光法分析和研究PV患者中Th17细胞、CD4+、CD25+调节性T细胞表达水平及临床意义。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2017年6月至2018年6月重庆市第六人民医院皮肤科收治的64例PV患者为PV组，另选取同期健康体检者40例为健康对照组。PV组中，男34例，女30例；年龄20～60岁，平均年龄(36.20±16.60)岁；PV患者的严重程度和皮损面积指数(PASI)按PASI评分为7.50～22.4分，平均评分(13.40±3.75)分，其中PASI≤25分为轻度，PASI>25分为重度；病程9 d～20年，平均病程(10.10±5.89)年。经临床相关检查或其他如组织病理学检查等确诊为PV，且符合相关临床诊断标准；PV患者典型临床表现为红色炎性丘疹、银白色鳞屑和红斑皮疹等；1个月内免疫抑制剂或糖皮质激素尚未使用；既往无银屑病等皮肤病史。健康对照组中，男28例，女12例；年龄19～66岁，平均年龄(38.49±14.16)岁。1个月内未发生真菌、细菌或病毒感染。2组性别比和年龄差异无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。

1.2 试剂与仪器 (1)仪器：采用流式细胞仪(由美国BD公司购入)。(2)试剂：人调节性T细胞荧光抗体标记试剂盒，包括同型对照抗体PE-Cy5 Rat IgG2aFITC抗人CD4、Fixation/Permeabilization、PE-Cy5抗人Foxp3、PE抗人CD25和刺激剂Cell Stimulation Cocktaul(由ebioscience公司购入)；人淋巴细胞分离液(由TBD公司购入)；破膜剂FIX&PERM Kit(由Multi Sciences公司购入)；FITC抗人CD3抗体、PerCP抗人CD8a、PE抗人IL-17A 抗体和同型对照(由BioLegend 公司购入)；RP-MI1640培养液(由Gibco公司购入)、小牛血清(由四季青购入)。

1.3 检测方法

1.3.1 CD4+CD25+T细胞:采用肝素抗凝2 ml静脉血，20 μl抗CD4-FITC、100 μl全血和20 μl抗CD25-APC标记抗体和20 μl mouse γ1 APC、100 μl全血和20 μl mouseγ1 FITC分别于2支试管中。室温避光，时间为20 min，溶血素2 ml加入，室温避光，时间为10 min，1 000 r/min，离心弃上清，2 ml磷酸盐缓冲液加入，1 000 r/min，离心弃上清，PBS，1 000 r/min，离心弃上清，500 μl 1%多聚甲醛固定加入，采用流式细胞仪检测。

1.3.2 Foxp3+T细胞:采用肝素抗凝3 ml静脉血，外周血单个核细胞分离采用密度梯度离心法，分别加入20 μl抗CD4-FITC、mouse γ1 FITC、抗CD25-APC、mouse γ1 APC于1×106个细胞中，混匀，避光孵育，时间为30 min，1 ml破膜剂加入，避光孵育，时间为45 min，20 μl rat IgG2a PE和抗Foxp3-PE加入，避光孵育，时间为30 min，洗涤，采用流式细胞仪检测。

1.3.3 细胞因子IL-10、TGF-β1:采用肝素抗凝10 ml静脉血，外周血单个核细胞分离采用Ficoll淋巴细胞分层液的密度梯度离心法，于37℃和5% CO2RPMI 1640培养基中移入，20 ng/ml植物血凝素A加入。分别加入20 μl mouse γ1 FITC、抗CD4-PE、抗CD25-APC和mouse γ1APC于流式反应管中，混匀。1 ml破膜剂加入，避光孵育45 min，分别加入生物素化抗TGF-β1 抗体、抗 IL-10-FITC和亲和素-FITC，于室温避光，时间为20 min，PBS洗涤，重悬，采用流式细胞仪检测。

1.3.4 Th17细胞:于24孔培养板内加入2×106/ml外周血单个核细胞悬液，1 ml/孔，刺激剂加入，于37℃和5% CO2培养箱中5 h。细胞给予离心弃上清，500 μl 破膜剂加入，于4℃孵育，时间为15 min，离心弃上清，细胞收集分组，FITC-CD320 μl、PerCP-CD8a Anti body 5 μl、PE-IL-17A 20 μl和PE-IgG 15 μl加入。PBS洗涤，于300 μl洗涤液重悬细胞中，采用流式细胞仪检测。

2 结果

2.1 健康对照组与PV患者进行期组和静止期组CD4+CD25+Foxp3+T细胞及CD4+CD25+T细胞水平比较 健康对照组CD4+CD25+Foxp3+T细胞及CD4+CD25+T细胞水平明显高于PV进行期患者，差异有统计学意义(P<0.05)；健康对照组CD4+CD25+Foxp3+T细胞及CD4+CD25+T细胞水平明显高于PV静止期患者，差异有统计学意义(P<0.05)。见表1。

组别CD4+CD25+Foxp3+ T细胞CD4+CD25+T细胞健康对照组(n=40)6.02±1.95∗4.94±1.36∗进行期组(n=32) 4.54±1.103.84±0.88静止期组(n=32) 5.25±1.374.30±1.25F值8.127.69P值<0.01<0.01

2.2 健康对照组与PV患者进行期组和静止期组CD4+CD25+T细胞IL-10和CD4+CD25+TGF-β细胞水平比较 健康对照组CD4+CD25+T细胞IL-10和CD4+CD25+TGF-β细胞水平明显高于PV进行期患者，差异有统计学意义(P<0.05)；健康对照组CD4+CD25+T细胞IL-10和CD4+CD25+TGF-β细胞水平明显高于PV静止期患者，差异有统计学意义(P<0.05)。见表2。

2.3 PV组和健康对照组Th17细胞水平比较 健康对照组Th17细胞水平明显低于PV组，差异有统计学意义(P<0.05)。见表3。

组别CD4+CD25+T细胞 IL-10CD4+CD25+TGF-β健康对照组(n=40)16.34±9.97∗4.82±1.83∗进行期组(n=32) 11.56±5.632.64±0.96静止期组(n=32) 14.48±8.254.22±1.54F值2.9518.99P值<0.01<0.01

组别Th17细胞PV组(n=64)2.19±0.77健康对照组(n=40)0.64±0.21 t值12.425 P值<0.01

2.4 CD4+CD25+Foxp3+T细胞和CD25+IL-10+T细胞及CD25+TGF-β+T细胞与疾病严重程度PASI的相关性 Pearson相关性分析可知，PASI与CD25+TGF-β+T细胞无相关性(P>0.05)；PASI 与CD4+CD25+Foxp3+T细胞和CD25+IL-10+T细胞呈负相关(P<0.05)。见表4。

表4 CD4+CD25+Foxp3+T细胞和CD25+IL-10+T细胞及CD25+TGF-β+T细胞与疾病严重程度PASI的相关性分析

2.5 Foxp3+Treg细胞、Treg细胞、Th17细胞与疾病严重程度PASI的相关性 Foxp3+Treg细胞和Treg细胞呈正相关(r= 0.563，P<0.05)，Treg细胞和Th17细胞呈负相关(r= -0.522，P<0.05)；Treg细胞和Th17细胞和PASI无相关性(r值分别为0.021、0.076，P>0.05)。

3 讨论

临床资料表明，PV患者重要病理特征之一为T淋巴细胞浸润，其发病与Treg、Th17 细胞密切相关[7,8]。Treg细胞可使机体自身免疫耐受维持，因兼备免疫调节和免疫抑制作用；Th17细胞在机体炎性反应发挥重要作用，因Th17细胞为重要炎性细胞，释放趋化因子和前炎性细胞因子可通过分泌IL-17诱导实现；调节性T细胞的一个重要标记和转录因子forkhead/winged helix家族的新成员为叉状头/翅膀状螺旋转录因子即Foxp3，其在Treg细胞的分化与功能方面发挥重要作用，可参与其中，通过3种途径实现，分别为对Foxp3 的转录水平进行特异性调控相互、 翻译后修饰调控Foxp3蛋白和作用于其他转录因子。自身免疫疾病与Foxp3基因的突变息息相关[9-11]。

TGF-β和 IL-10为Tr细胞分泌的2个重要细胞因子[12，13]。TGF-β在细胞的分化中发挥重要作用，可诱导CD4+T细胞转化为CD4+CD25+Foxp3+T细胞，TGF-β为多效性细胞因子，在骨的形成、骨的钙化成、骨细胞分泌、合成、增殖和分化中发挥着重要促进作用，在骨的吸收方面发挥重要抑制作用[14]。Foxp3基因突变与PV进展和TGF-β异常改变密切关联[15]。重要免疫负调节因子IL-10为B细胞活化因子和CTL分化因子，IL-2可通过IL-10被直接抑制。IL-10在巨噬细胞和单核细胞产生NO、辅助刺激分子和单核细胞表达MHC-1I类抗原、增殖Th17细胞、激活抗原特异性T细胞和前炎性细胞因子的产生方面发挥抑制作用。IL-2Rα链为CD25分子，效应细胞产生IL-2被被动地吸收为CD25+T 细胞介导抑制作用的一个重要机制。初始T细胞分化为Th17细胞可通过IL-6和TGF-β共同作用实现，银屑病皮损处的炎性反应由于Th17细胞通过产生一系列促炎因子加重[16-18]。

外周血和皮损中健康正常人CD4+CD25+调节性T细胞的功能和数目明显高于PV患者，无缺陷的效应性T细胞的调节功能为健康正常人的表现，相反地，缺陷的效应性T细胞的调节功能为PV患者的表现[19,20]。本研究结果显示，健康对照组CD4+CD25+Foxp3+T细胞及CD4+CD25+T细胞水平明显高于PV进行期患者；健康对照组CD4+CD25+Foxp3+T细胞及CD4+CD25+T细胞水平明显高于PV静止期患者；健康对照组CD4+CD25+T细胞IL-10和CD4+CD25+TGF-β的细胞水平明显高于PV进行期患者；健康对照组CD4+CD25+T细胞IL-10和CD4+CD25+TGF-β的细胞水平明显高于PV静止期患者；健康对照组Th17细胞水平明显低于PV组；经Pearson相关性分析可知，PASI与CD25+TGF-β+T细胞无相关性；PASI 与CD4+CD25+Foxp3+T细胞和CD25+IL-10+T细胞呈负相关；Foxp3+Treg细胞和Treg细胞呈正相关，Treg细胞和Th17细胞呈负相关；Treg细胞和Th17细胞和PASI无相关性。提示下降的CD4+CD25+调节性T细胞、Foxp3、IL-10和TGF-β的和上升的Th17细胞为PV病情发展的重要影响因素，即缺失的免疫功能和调节性T细胞数量的减少介导PV的发生与发展。

综上所述，PV病情发展与CD4+CD25+调节性T细胞、Foxp3、IL-10和TGF-β的表达下降和Th17细胞表达上升有关。