刘国林，陶金忠，白玲荣，李向龙，陈永宏，张 萌，罗 芳，李亚超，郭延生

(宁夏大学 农学院，宁夏 银川 750021)

奶牛围产期是指产前21 d到产后21 d的一段时期[1]。由于妊娠、分娩等因素[2]，奶牛在围产期的生理和代谢会发生剧烈变化，易导致神经内分泌和免疫状态改变，使奶牛免疫力下降[3]。奶牛由于乳腺发育、乳的合成和分泌以及能量摄入量的不足而处于能量负平衡状态，引起脂肪动员，进而导致血液中非酯化脂肪酸(NEFA)和酮体含量升高[4]。因此，如何缓解围产期的能量负平衡和免疫抑制是奶牛生产上亟待解决的问题，也是当前研究的热点和难点。奶牛日粮中添加中草药可提高采食量、减轻能量负平衡和提高免疫力，从而降低产后患病的风险[5]。前人研究发现，山楂具有降血糖、降血脂、抗氧化应激、改善胰岛素抵抗、抗炎等作用[6]。张美英[7]研究了山楂提取物对肉仔鸡的饲喂效果，发现山楂可以降低胃pH值，激活胃蛋白酶原，提高消化酶活力。韩瑞阳[8]研究发现，山楂可通过降低甘油三酯、胆固醇、低密度脂蛋白及升高高密度脂蛋白含量，来调节脂代谢紊乱。黄芪具有抗菌、抗病毒、提高机体免疫力及抗氧化功能，改善肠道微生态等作用，其中以免疫调节作用最为突出[9]。黄芪多糖可激活机体内淋巴细胞，引起特异性免疫应答反应，还可激活巨噬细胞、自然杀伤细胞、树突状细胞等免疫细胞以及诱导分泌细胞因子从而激活非特异性免疫应答反应[10]。目前，山楂和黄芪在围产期奶牛中的应用尚未见报道。因此，以健胃消食、增强免疫力为原则，将不同剂量山楂和黄芪添加到奶牛日粮中，研究山楂和黄芪对围产期奶牛血液生化指标和免疫指标的影响，旨在为山楂和黄芪在奶牛生产中的应用提供参考。

1 材料和方法

1.1 主要试验仪器

全自动生化分析仪(BS-180，深圳迈瑞公司)、冰箱(BCD-576WDPU，青岛海尔股份有限公司)、-86 ℃超低温冷冻储存箱(DW-HL388，中科美菱低温科技股份有限公司)、离心机(TGL-16，江苏中大仪器科技有限公司)、培养箱(GNP-9270，上海精宏实验设备有限公司)、酶标仪(MB-530，深圳市汇松科技发展有限公司)、移液枪(Eppendorf所有规格)、血酮检测分析仪(Nova Vet，北京哈罗德科技有限公司)等。

1.2 主要试验材料与试剂

山楂和黄芪粉购于甘肃兰州黄河中药市场。钙(Ca)、磷(P)、白蛋白(ALB)、肌酸激酶(CK)、碱性磷酸酶(ALP)、葡萄糖(Glu)、总蛋白(TP)、肌酐(CREA)、谷氨酰胺转肽酶(GGT)含量测定试剂盒均购自深圳迈瑞生物医疗电子股份有限公司；非酯化脂肪酸(NEFA)含量测定试剂盒购自南京建成生物工程研究所；酮体含量检测试纸条购自北京哈罗德科技有限公司；牛免疫球蛋白G(IgG)、牛肿瘤坏死因子α(TNF-α)含量测定试剂盒购自武汉华美生物工程有限公司。

1.3 试验设计与饲养管理

试验于2018年5月7日—7月15日在宁夏某养殖场进行。选择2～4胎次上一个产奶周期产奶量接近的健康围产期(产前21 d—产后21 d)荷斯坦奶牛45头，随机分成3组(A组、B组、C组)，每组15头。A组饲喂基础日粮(表1)，B组和C组分别在基础日粮中添加100 g/(头·d)和300 g/(头·d)山楂和黄芪(山楂与黄芪1∶1)，所有饲喂管理方式按照该牧场管理标准执行，自由采食和饮水，每天饲喂3次，全混合日粮(Total mixed rations，TMR)饲喂。从预产期前21 d开始饲喂，到产后21 d试验结束。

表1 围产前期和围产后期奶牛基础日粮组成(干物质基础)Tab.1 Composition of basic diet of dairy cows in perinatal and late perinatal period (DM basis) %

1.4 样品采集

根据预产期妊娠天数280 d，于-21 d、-7 d、0 d、+7 d和+21 d尾静脉采集血液10 mL，肝素钠抗凝，迅速3 000 r/min离心10 min，收集血浆，-80 ℃保存。

1.5 血液指标的测定

血浆常温下解冻，参照测定试剂盒的使用方法，应用全自动生化分析仪检测Ca、P、CK、ALP、Glu、CREA、GGT、ALB、TP、GLB含量；使用酶标仪检测NEFA、IgG和TNF-α含量；使用血酮分析仪检测酮体含量。

1.6 数据分析

数据经Excel 2010整理后，使用SPSS 22.0软件进行单因素方差分析，用Duncan’s法多重比较，试验数据用平均值±标准差表示。

2 结果与分析

2.1 山楂和黄芪对围产期奶牛GGT和ALP含量的影响

由表2可知，与A组相比，0 d时，B组和C组GGT含量分别显著下降22.01%和21.21%(P<0.05)，+7 d时，B组显著下降20.40%(P<0.05)、C组极显著下降26.36%(P<0.01)，+21 d时，B组和C组分别极显著下降28.92%和34.18%(P<0.01)，C组ALP含量显著下降31.39%(P<0.05)，其他时期差异不显著。

表2 山楂和黄芪对围产期奶牛GGT和ALP含量的影响Tab.2 Effects of hawthorn and Astragalus on GGT and ALP contents in perinatal dairy cows U/L

注：同行数据后不同小写字母表示差异显著(P<0.05)，不同大写字母表示差异极显著(P<0.01)，下同。
Note:The different lowercase letters in the same row mean significant difference (P<0.05),different capital letters mean extremely significant difference(P<0.01),the same below.

2.2 山楂和黄芪对围产期奶牛CREA和CK含量的影响

由表3可知，与A组相比，+21 d时，B组CREA含量显著下降7.74%(P<0.05)，C组极显著下降22.54%(P<0.01)；-7 d时，B组CK含量显著下降47.02%(P<0.05)；其他时期差异不显著。

表3 山楂和黄芪对围产期奶牛CREA和CK含量的影响Tab.3 Effects of hawthorn and Astragalus on CREA and CK contents in perinatal dairy cows

2.3 山楂和黄芪对围产期奶牛TP、ALB和GLB含量的影响

由表4可知，与A组相比,+21 d时，B组TP含量极显著升高44.10%(P<0.01)，C组显著升高28.06%(P<0.05)；B组和C组ALB含量分别极显著升高20.73%和19.56%(P<0.01)；B组GLB含量极显著升高66.16%(P<0.01)；其他时期差异不显著。

表4 山楂和黄芪对围产期奶牛TP、ALB和GLB含量的影响Tab.4 Effects of hawthorn and Astragalus on TP,ALB and GLB contents in perinatal dairy cows g/L

2.4 山楂和黄芪对围产期奶牛Ca和P含量的影响

由表5可知，与A组相比，+7 d时,B组和C组Ca含量分别极显著升高47.28%和45.65%(P<0.01)，+21 d时，B组显著升高41.67%(P<0.05)；与A组相比，+21 d时，B组P含量极显著升高33.57%(P<0.01)；其他时期差异不显著。

表5 山楂和黄芪对围产期奶牛Ca和P含量的影响Tab.5 Effects of hawthorn and Astragalus on Ca and P contents in perinatal dairy cows mmol/L

续表5 山楂和黄芪对围产期奶牛Ca和P含量的影响Tab.5(Continued) Effects of hawthorn and Astragalus on Ca and P contents in perinatal dairy cows mmol/L

2.5 山楂和黄芪对围产期奶牛Glu、NEFA和酮体含量的影响

由表6可知，与A组相比，0 d时，B组和C组Glu含量分别显著升高24.49%和23.72%(P<0.05)；与A组相比，+7 d时，C组NEFA含量显著下降27.16%(P<0.05)，+21 d时，B组极显著下降34.38%(P<0.01)；与A组相比，+21 d时，B组酮体含量显著下降25.93%(P<0.05);其他时期差异不显著。

表6 山楂和黄芪对围产期奶牛GLU、NEFA和酮体含量的影响Tab.6 Effects of hawthorn and Astragalus on GLU,NEFA and ketone body contents in perinatal dairy cows mmol/L

2.6 山楂和黄芪对围产期奶牛IgG和TNF-α含量的影响

由表7可知，-7 d、0 d、+7 d和+21 d时，与A组相比，B组和C组IgG含量显著或极显著升高(P<0.05或P<0.01)，B组TNF-α含量显著或极显著升高(P<0.05或P<0.01)。

表7 山楂和黄芪对围产期奶牛TNF-α、IgG含量的影响Tab.7 Effects of hawthorn and Astragalus on TNF-α and IgG contents in perinatal dairy cows

3 结论与讨论

3.1 山楂和黄芪对围产期奶牛GGT和ALP含量的影响

围产期奶牛由于能量负平衡而引发脂肪动员，可导致肝脏脂肪沉积，会引起脂肪肝，从而损伤肝脏功能。ALP和GGT在临床上用于反映肝脏功能的状态，主要分布在肝脏、心肌、骨骼肌及肾脏等组织细胞中，当上述组织细胞受损时，会导致其活性升高。李召阳[11]在妊娠母猪的饲料中添加黄芪多糖，发现黄芪多糖对妊娠母猪的肝脏起到良好的保护作用。乔靖怡等[12]研究发现，山楂总黄酮能显著降低肝脏损伤大鼠的肝脏指数，减轻肝脏损伤的程度。高志强等[13]研究发现，不同配比的山楂叶、果能显著降低脂肪肝大鼠血清GGT与ALP含量(P<0.01或0.05)。本研究结果表明，在围产期奶牛日粮中添加山楂和黄芪，奶牛血浆中GGT与ALP含量降低，表明山楂和黄芪添加可保护奶牛肝脏功能。但GGT及ALP水平的变化与奶牛脂肪动员而造成的肝脏损伤的相关性还有待于进一步研究。

3.2 山楂和黄芪对围产期奶牛CREA和CK含量的影响

CREA主要是由肌肉中的肌酸通过不可逆的非酶脱水反应生成后释放进入血液中，主要由肾小球的过滤能力来决定，其在血液中含量低表明肾脏排泄功能强[14]。在妊娠母猪饲料中添加黄芪多糖，发现黄芪多糖在一定程度上显著增强了肾脏的排泄功能[11]。本研究结果表明，在围产期奶牛日粮中添加山楂和黄芪，产后奶牛血浆中CREA含量降低。可见，山楂和黄芪添加改善了产后奶牛肾脏排泄功能。

在动物的心脏、肌肉以及脑等组织的细胞浆和线粒体中CK含量最多，当这些组织受到损伤后CK会立即释放入血液中，使血清CK含量迅速升高，所以临床上CK含量被作为诊断心脏损伤的重要指标。在妊娠母猪饲料中添加黄芪多糖，母猪血液中CK含量显著降低[11]。邱晓梅等[15]研究表明，山楂叶总黄酮(HLF)可明显减轻大鼠心肌缺血损伤程度，从而保护心肌功能。本研究结果表明，在奶牛围产期日粮中添加山楂和黄芪能降低产前奶牛血浆CK含量。可见，山楂和黄芪添加可保护奶牛心脏功能。

3.3 山楂和黄芪对围产期奶牛TP、ALB和GLB含量的影响

血清TP是由ALB和GLB组成的，TP、ALB、GLB都是由肝脏合成的，作为反映肝细胞蛋白合成代谢功能的指标[16]。研究表明，在妊娠母猪饲料中添加黄芪多糖提高了机体对蛋白质利用以及代谢能力[11]。苏凤艳等[17]研究发现，复方黄芪可显著提高鹌鹑血液中TP含量。彭宏刚等[18]向仔猪和育肥猪的饲料中添加黄芪多糖，血清TP和ALB的含量升髙。本研究中，ALB在分娩前后略有降低，可能由于分娩后奶牛发生能量负平衡，肝脏合成的ALB减弱或乳蛋白合成的增加导致ALB的分解代谢率增加[19]。TP和GLB在0 d时略有降低，与王建国[20]研究一致，表明产后脂肪动员在一定程度上影响了肝脏的储备能力，使得蛋白质代谢受到影响[21]。本研究结果表明，在奶牛围产期日粮中添加山楂和黄芪能升高产后奶牛血浆中TP、ALB和GLB含量，这可能是由于山楂和黄芪促进产后奶牛蛋白质吸收、维持蛋白质代谢。

3.4 山楂和黄芪对围产期奶牛Ca和P含量的影响

钙、磷是动物体内含量最多的无机盐，几乎所有奶牛产犊后血钙的浓度都会下降。桑松柏[22]研究发现，奶牛围产期血浆Ca水平呈现产前21 d至分娩逐渐下降，分娩时最低，产后逐渐上升的趋势；P水平总体呈现产前21 d至分娩略降低，分娩时最低，产后缓慢升高，产前总体水平高于产后的趋势。王亮[2]研究发现，在围产期Ca出现先下降后上升的趋势，在分娩当天下降至最低。本研究结果与上述结果一致，在围产期奶牛日粮中添加山楂和黄芪能升高产后奶牛Ca和P水平，这可能是由于山楂和黄芪调节Ca、P代谢。

3.5 山楂和黄芪对围产期奶牛GLU、NEFA和酮体含量的影响

血清GLU是衡量机体内能量平衡与否的常用指标。丁娅楠[23]研究发现，围产期奶牛血清GLU浓度在分娩当天显著高于产前和产后，分娩后GLU浓度逐渐降低，至产后7 d时降至最低，之后趋于平缓。本研究中，GLU浓度从产前7 d开始急剧升高，至分娩期达峰值，此后逐渐降低，与丁娅楠[23]的研究结果一致，日粮中添加山楂和黄芪后分娩当天奶牛GLU含量升高。可见，山楂和黄芪添加能改善分娩当天能量负平衡。

NEFA主要是判定能量负平衡程度的重要指标。通常奶牛产后达到产奶高峰后几周，干物质采食量才能恢复正常，但能量负平衡在分娩后第7天最明显。SEIFI等[24]发现，奶牛血清NEFA水平在分娩时增加，产后第8天达到峰值，然后开始逐渐降低。MENDOZA等[25]发现，奶牛在产犊和产后7 d血清NEFA含量升高，7～14 d后开始降低,56 d降至产前水平。熊桂林等[26]研究表明，血清NEFA含量产前30 d变化不明显，分娩当天突然升高，产后5～10 d达到最高水平，之后降低，至产后20 d仍显著高于产前。本研究中，NEFA从-21 d开始逐渐升高，至+7 d最高，之后逐渐下降，日粮中添加山楂和黄芪产后奶牛NEFA含量降低。可见，添加山楂和黄芪缓解了产后奶牛的能量负平衡。

体脂动员产生的NEFA超过肝脏的氧化能力就会转化为酮体。王建国[20]研究发现，酮体含量从分娩期开始急剧升高，至产后7 d达峰值，此后降低，但仍保持较高水平，同时发现产前血清NEFA含量与产后酮体含量之间呈正相关。本研究中，酮体从-7 d开始急剧升高，至+7 d达峰值，此后逐渐降低。由于产后奶牛存在严重的能量负平衡，奶牛动员体脂产生了大量NEFA，进而导致酮体含量升高，而添加山楂和黄芪降低了产后酮体含量。

3.6 山楂和黄芪对围产期奶牛IgG和TNF-α含量的影响

奶牛在围产期由于生理、代谢和泌乳的开始，会使其神经内分泌和免疫调节发生很大的变化，容易出现不同程度的免疫抑制现象，因此，急需提高围产期奶牛免疫力。李珊珊[27]研究发现，奶牛围产期免疫功能与其临近分娩以及分娩后血清IgG的变化有关。李春燕等[28]研究发现，黄芪、山楂、杜仲叶等多味中药组成的添加剂能显著提高免疫细胞百分率，增强动物非特异性免疫功能和细胞免疫功能。吕轩[29]研究发现，当归黄芪提取物复方制剂显著提高了母猪血浆IgG的含量。金东春[30]研究发现，黄芪复方中草药添加剂明显提高了东北黑脚麻鸡血清中IgG和IgM的含量。苏凤艳等[17]研究发现，复方黄芪饲料添加剂能够提高鹌鹑血清中IgG和IgA含量，提高机体免疫力，增强抗病力。本研究结果表明，在围产期奶牛日粮中添加山楂和黄芪能升高奶牛血浆中IgG含量，这可能是山楂和黄芪提高了奶牛免疫力。但是山楂和黄芪提高围产期奶牛免疫力的机制还有待于进一步研究。

有研究表明，围产期奶牛免疫功能的紊乱与血清TNF-α在产前变化有关[31]。TNF-α属于单核因子，或称促炎因子，参与机体局部或系统反应，是炎症和发热过程中的关键调节因子，具有较广泛的生物学活性，还具有免疫调节功能，能刺激合成IL-1、IL-6、IL-8等多种细胞因子，影响脂类代谢和糖代谢过程[32]。有研究指出，血浆中TNF-α增高，可以使机体获得强烈的抗炎作用，能加速机体对炎症的应答[33]；吕建存等[34]研究发现，奶牛围产期喂服中药后，可明显提高围产期奶牛血浆TNF-α含量，增强围产期奶牛的免疫水平。本研究结果与前人研究结果一致，说明山楂和黄芪可影响围产期奶牛细胞免疫。

综上，在围产期奶牛日粮中添加100 g/(头·d)山楂和黄芪时能显著影响产后奶牛脂类、蛋白质和Ca、P代谢，减轻产后能量负平衡，降低产后酮体水平，提高奶牛的免疫力。