心脏不停跳大鼠单肺体外循环肺损伤模型的建立

2020-03-10刘科宇张红何苗谢菲李倩于承坤

中国现代医学杂志 2020年3期

刘科宇，张红，何苗，谢菲，李倩，于承坤

（1.遵义医科大学麻醉医学院，贵州遵义 563000；2.成都大学附属医院麻醉科，四川成都 610081；3.遵义市第一人民医院重症医学科，贵州遵义 563000）

目前体外循环（cardiopulmonary bypass, CPB）技术已广泛应用于临床心血管手术和非心血管手术中，但CPB 后各重要脏器的病理生理改变，一直是人们关注的重点。为进一步研究相关保护措施，国内外已经复制了多种CPB 动物模型，如：猴[1]、猪[2]、狗[3]等。因大鼠基因与人同源程度高、个体差异小、可重复性强，价格低廉、品系纯正，同时大鼠体型小，适合单人操作，使实验操作差异性明显减小[4]，所以大鼠CPB 模型越来越受到科研人员的重视，但目前针对CPB 肺损伤及肺保护的大鼠CPB 模型还鲜有报道。

1 材料与方法

1.1 实验动物

健康成年SD 大鼠24 只。雄性，体重350～500g，4～8个月，清洁级，由陆军军医大学大坪医院创伤外科研究所动物中心提供，许可证号：SCXK（渝）2012—0005。术前禁食12h，禁水2h。

1.2 实验设备

大鼠膜式氧合器（东莞科威医疗机械有限公司），小动物呼吸机（上海奥尔科特生物科技有限公司），BT100-2J 蠕动泵（兰格恒流泵有限公司），大鼠体温维持仪（瑞沃德生命科技有限公司），MD3000 型生物信号采集处理系统（淮北正华生物仪器设备有限公司），GEM Premier 3000 血气分析仪（美国实验仪器公司），ACT 仪（美国美敦力公司），WZS-50F2 双通道输液泵（浙江大学医学仪器有限公司），16、20 及22G 静脉留置针（贝朗医疗上海国际贸易公司）。

1.3 实验方法

1.3.1 CPB 管道的准备 CPB 管道由储血室（20ml注射器）、大鼠膜肺、蠕动泵、硅胶管（外径约4mm，内径约3mm，长为60cm）以及动静脉管路组成。动物实验前，连接CPB 管道，连接氧气源，用羟乙基淀粉9ml、甘露醇1ml、钠钾镁钙葡萄糖注射液1ml及5%碳酸氢钠1ml 预充CPB 管道，排净空气。

1.3.2 实验分组将24 只大鼠随机分为单纯开胸组（T 组）、单纯CPB 组（C 组）、缺血再灌注组（IR 组），每组8 只。T 组仅开胸，C 组开胸后仅建立CPB 模型，IR 组开胸后建立大鼠CPB 左肺缺血再灌注损伤模型。

1.3.3 模型的建立采用1%戊巴比妥钠（腹腔内注射，50mg/kg）麻醉大鼠。麻醉后仰卧位固定大鼠，行尾静脉穿刺置管。用加热毯给大鼠保温。喉镜明视下行气管插管，气管导管连接小动物呼吸机，并行机械通气，维持潮气量15ml/kg，呼吸频率60 次/min，I ∶E=1.0 ∶2.5，FiO2∶99%。分离右侧股动静脉及左侧股静脉并穿刺置管，右侧股动脉连接生物信号采集处理系统监测大鼠心率和血压。将体温计插入大鼠肛门5mm 处以检测核心温度。尾静脉注射肝素 5mg/kg，待全身肝素化后，以双侧股静脉作为静脉端引流，右侧颈总动脉作为动脉端回流连接CPB 管道，待ACT＞480s 后开始转机；并行循环10min 后经左侧第4 肋间开胸夹闭左侧肺门，行右肺单肺通气，调节适合的潮气量及呼吸频率；并行循环45min 后，开放左肺门，恢复双肺通气；并行循环30min 后停止CPB；停机90min 后实验结束。CPB 期间采用体温维持仪使肛温维持在32～34℃，维持平均动脉压（MAP）50～80mmHg，灌注流量40 ml/（kg·min）；非CPB 期间维持肛温在36.0～37.5℃，MAP 60～110mmHg。停机前尾静脉注射鱼精蛋白中和多余肝素，机血回收后从尾静脉输入大鼠体内。术中通过动脉血气分析结果调节大鼠内环境的稳定性，采用镇静药、镇痛药和肌松药来维持麻醉深度，必要时给予血管活性药物维持大鼠生命体征。术中大鼠留置胃管行胃肠减压，留置尿管用于术中尿液引流[5]。见图1。

1.3.4 标本的采集分别于CPB 前（T1）、开放左肺门即刻（T2）及实验结束时（T3），经股动脉抽取动脉血0.5ml 行血气分析，记录红细胞压积（Hct）及血乳酸（Lac），并计算氧合指数（OI）和呼吸指数（RI）。实验结束时经股动脉抽取动脉血2ml，离心后取上清液，于-80℃冰箱保存，采用ELISA 法检测血清白细胞介素-1β（Interleukin-1β, IL-1β）和肿瘤坏死因子α（tumor necrosis factor α, TNF-α）的含量。取完血液标本后，剪取左肺组织，并分为上下两部分。左肺上部经4% 多聚甲醛固定后，行光学显微镜检查及病理损伤评分；左肺下部经液氮冻存后，于-80℃冰箱冷冻保存，采用ELISA 法检测肺组织IL-1β 和TNF-α 的含量。取完标本后，大鼠注入过量麻药处死。

1.3.5 指标的检测 ①肺功能检测：根据动脉血气分析结果计算氧合指数（OI=PaO2/FiO2）、呼吸指数（RI= P（A-a）O2/PaO2）。校正氧合指数＝PaO2/[FiO2×（P/760）]；肺泡-动脉血氧分压差[P（A-a）O2]=（P- PH2O）×FiO2-PaO2-PaCO2/0.8；PH2O 为饱和水蒸气压，标准状态下为47mmHg；P 为实际大气压强，遵义地区为680mmHg；FiO2（%）为吸入氧浓度，本动物实验模型为99%。②肺组织光学显微镜检查及病理损伤评分：左肺组织经4%多聚甲醛固定后，石蜡包埋处理。用切片机将包埋好的石蜡切成3～5μm 薄片，先后经50%乙醇和正丁醇2 次脱水，经二甲苯脱蜡3 次（切片脱蜡要完全，否则妨碍正常染色），HE染色后封片，在光学显微镜下观察肺组织形态，并拍摄图片保存；每张病理切片随机选择3个高倍镜视野（×100），采用CHENG 等[6]和DOS SANTOS 等[7]标准进行评分。按照肺泡及肺泡间质有无水肿液、红细胞渗出及炎症细胞浸润进行评分，并取平均值作为此切片的评分。③ELISA 检测：按照ELISA 试剂盒说明书检测血浆及肺组织中TNF-α 和IL-1β 含量变化。由于CPB 后血液稀释的影响，血浆TNF-α 和IL-1β的含量按如下公式进行校正：校正值=实测值×转机前血细胞比积（Hct）值/实际Hct 值。

图1 大鼠单肺体外循环肺损伤模型图

1.4 统计学方法

数据分析采用SPSS 17.0 统计软件。计量资料以均数±标准差（±s）表示，比较采用重复测量设计的方差分析或单因素方差分析，进一步两两比较采用LSD-t检验，P＜0.05 差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠血流动力学指标变化

T 组、C组与IR组大鼠T1、T2、T3的HR比较，符合正态分布和球形检验，采用重复测量设计的方差分析，结果：①不同时间点的HR 有差异（F=22.372，P= 0.000）；②3 组间的HR 有差异（F=8.701，P=0.000）；③3组HR变化趋势有差异（F=7.556，P=0.000）。见表1。

T 组、C 组与IR 组大鼠T1、T2、T3的MAP 比较，符合正态分布和球形检验，采用重复测量设计的方差分析，结果：①不同时间点的MAP 有差异（F=66.997，P=0.000），②3 组间的MAP 有差异（F=7.104，P= 0.000），③3 组MAP 变化趋势有差异（F=14.758，P= 0.000）。见表1。

2.2 各组大鼠Hct 及Lac 的变化

T 组、C 组和IR 组在T1、T2、T3不同时间的Hct比较，符合正态分布和球形检验，采用重复测量设计的方差分析，结果：①不同时间点的Hct 有差异（F= 54.630，P=0.000）；②3 组间的Hct 有差异（F= 188.425，P=0.000）；③3 组的Hct 变化趋势有差异（F= 25.538，P=0.000）。见表2。

T 组、C组和IR 组大鼠T1、T2、T3的Lac比较，符合正态分布和球形检验，采用重复测量设计的方差分析，结果：①不同时间点的Lac有差异（F=66.464，P= 0.000）；②3 组间大鼠的Lac 有差异（F=55.746，P= 0.000）；③3 组的Lac 变化趋势有差异（F=10.733，P= 0.000）。见表2。

表1 各组大鼠不同时间点血流动力学指标比较（n =8，±s）

2.3 各组大鼠OI 及RI 的变化

T 组、C 组与IR 组大鼠T1、T2、T3的OI 比较，符合正态分布和球形检验，采用重复测量设计的方差分析，结果：①不同时间点的OI 有差异（F=63.795，P= 0.000）；②3 组间大鼠的OI 有差异（F=75.493，P= 0.000）；③3 组OI 变化趋势有差异（F=29.727，P= 0.000）。见表3。

T 组、C 组与IR 组大鼠T1、T2、T3的RI 比较，符合正态分布和球形检验，采用重复测量设计的方差分析，结果：①不同时间点的RI 有差异（F=35.491，P= 0.000）；②3 组间大鼠的RI 有差异（F=46.995，P= 0.000）；③3 组RI 变化趋势有差异（F=25.699，P= 0.000）。见表3。

2.4 各组大鼠肺组织病理学评分

T 组、C 组及IR 组大鼠在T3时肺组织病理损伤评分为（0.75±0.24）、（2.13±0.25）和（4.42±0.83）分，经单因素方差分析，差异有统计学意义（F=101.974，P=0.000），进一步两两比较，经LSD-t检验，C 组高于T 组（P＜0.05），IR 组高于T、C 组（P＜0.05）。T组肺组织结构较清晰，肺泡壁完整（见图2A）；C 组肺组织结构稍清晰，见少量肺泡壁塌陷及炎性渗出（见图2B）；IR 组肺组织结构紊乱，充满水肿液，肺泡壁断裂，可见红细胞和炎症细胞浸润（见图2C）。

表2 各组大鼠不同时间点Hct 及Lac 比较（n =8，±s）

表3 各组大鼠不同时点OI 及RI 比较（n =8，±s）

2.5 各组大鼠IL-1β、TNF-α 含量的变化

T 组、C 组、IR 组大鼠在T3时肺组织及血清中IL-1β、TNF-α 含量比较，差异有统计学意义（P＜ 0.05）。各组大鼠肺组织及血清中IL-1β、TNF-α 含量的变化趋势一致；C 组IL-1β、TNF-α 的含量均高于T 组（P＜0.05），IR 组IL-1β、TNF-α 的含量高于T组和C 组（P＜0.05）。见表4。

图2 各组T3 时间点肺组织病理切片（HE×100）

表4 各组大鼠T3 时间点血清、肺组织中IL-1β、TNF-α 含量的比较（n =8，ng/L，±s）

注：①与T 组比较，P ＜0.05；②与C 组比较，P ＜0.05。

3 讨论

目前大多数学者认为，导致CPB 肺损伤的原因主要是血液与管道接触、肝素-鱼精蛋白等引起的全身性炎症反应和主动脉开放后对肺组织造成的缺血再灌注损伤；据此特点本实验模型采用双侧股静脉作为静脉端引流，右侧颈总动脉作为动脉端回流进行CPB。预充液采用无血预充，总预充量为12 ml（晶体液:胶体液=1 ∶3），恰好为成年大鼠全身血容量的一半（成年大鼠血容量5.75～6.99 ml/100g）；大鼠正常平均心输出量为150～180 ml/（kg·min）[8]，经过预实验探索，本实验大鼠采用心脏不停跳CPB，流量控制在心输出量的1/4，约40 ml/（kg·min），可维持MAP 在50～80 mmHg；采用大鼠专用的小动物膜肺（交换面积0.05 m2，预充量3 ml）；实验在CPB 前行全身肝素化，停机时又给予鱼精蛋白拮抗；模拟血液与管道的接触以及肝素-鱼精蛋白等造成的全身炎症反应。同时本实验在CPB 过程中夹闭左侧肺门45 min 后开放左肺门，模拟心脏复跳后肺组织的缺血再灌注损伤。与临床实际操作不同，本实验中大鼠心脏并不停跳，减少动物的创伤，使实验动物能够长时间的保持循环稳定（左肺再灌注后可维持生命体征平稳超过2 h），亦排除因心脏缺血再灌注对肺功能的干扰。

临床常用OI 和RI 来作为判断肺功能的指标。OI常用来评价肺氧合和换气功能，与肺损伤呈正相关；RI 能客观反映肺组织的实际氧合情况，与肺功能状态呈负相关；两者可综合反映肺功能情况[9]。多种炎症细胞因子与CPB 肺损伤关系密切[10]，其中最重要的细胞因子主要包括TNF-α 和白细胞介素（IL-1β、IL-6）[11]。本实验中3 组大鼠T3时间点OI 低于T1，而RI 高于T1；说明随着时间的延长，3 组实验均可降低大鼠的肺功能。实验结束时，C 组大鼠肺组织病理损伤评分、肺组织及血浆中的IL-1β、TNF-α 的含量高于T 组；而肺功能则比T 组降低；说明CPB后导致的全身炎症反应可导致肺损伤。IR 组与C 组及T 组比较，大鼠Lac 浓度高于其他两组，大鼠的组织氧供及代谢情况比其他两组差；肺组织及血浆中的IL-1β、TNF-α 的含量，IR 组＞C 组＞T 组，而肺组织病理改变及肺功能下降程度，IR 组＞C 组＞T 组，表明IR 组左肺组织在左肺动脉开放后遭受CPB 全身炎症反应和血再灌注损伤的双重打击，大鼠全身炎症反应及肺组织损伤比其他两组严重，能模拟临床CPB 肺损伤的病理生理改变，大鼠单肺CPB 肺损伤自创模型成功建立。

大鼠的肺脏位于胸腔中部，分为左、右两部分。与人类解剖结构不同，大鼠左肺为一个大叶，右肺分为4 叶（前叶、中叶、副叶、后叶），本实验经左侧第4 肋间开胸可直接暴露左肺门，易于夹闭。另外，实验中夹闭肺门采用的是自制的小动物专用门脉闭合镊，能够轻松夹闭和开放肺门，减轻夹闭肺门时导致的损伤，利于动物的存活。在预实验中，笔者发现本实验的气管导管（16 G 静脉留置套管）没用套囊，在机械通气过程中易漏气，致腹腔压力增高、影响肺扩张，严重时可造成血流动力学的剧烈改变；经留置胃管后能很好地避免该类相关并发症的发生。实验中常规肌松剂的使用易导致尿储留，留置尿管后能改善尿液引流，更易于液体的平衡管理。同时，术中通过动脉血气分析结果调节大鼠内环境稳定，定时（间隔30～45 min）给予镇静、镇痛和肌松药来维持麻醉深度，以及实时监测和调控大鼠的血压、心率和体温，极大程度地模拟临床CPB 术中的管理。

综上所述，本自创实验模型成功模拟临床CPB 肺损伤的病理生理变化，适用于体外循环肺损伤及其机制的实验研究，有助于推动体外循环肺保护的研究。