EGFR靶向性MRI探针的制备及其与NSCC细胞靶向结合的研究*
2020-03-10刘成李烁张全明
刘成,李烁,张全明
(深圳市南山区人民医院 耳鼻喉科,广东 深圳 518000)
鼻咽部鳞状细胞癌(nasopharyngeal squamous cell carcinoma, NSCC)早期诊断困难,大多数诊断时已到晚期,错过手术最佳时机,患者的5年病死率较高,接近30%[1-2]。负载显影剂、靶向因子和化疗药物的多功能分子影像探针是肿瘤治疗研究的热点及难点,目前关于NSCC靶向显影与治疗多功能载体的研究较少[3-4]。本研究拟利用NSCC 表面表皮生长因子受体(epithelial growth factor receptor, EGFR)作为靶受体,构建EGFR靶向性的MRI 探针,从体外细胞水平探讨探针与NSCC 细胞靶向结合,为NSCC 早期诊治提供思路和技术参考[5-6]。
1 材料与方法
1.1 细胞、材料与试剂
NSCC 和正常鼻咽细胞系由中南大学肿瘤研究所曹亚教授提供,超小型超顺磁性氧化铁(USPIO)[TANBead ® USPIO-101(台湾先进纳米科技股份有限公司)核心为四氧化三铁Fe3O4纳米颗粒(Fe 浓度为 10 mg/ml),大小为6~10 nm,pH 值为(3.8±0.5)],阿霉素(北京百奥莱博科技有限公司,HPLC ≥ 99.0%),西妥昔单抗(Cetuximab, CET,德国默克里昂制药公司,规格100 mg ∶50 ml),甲醇分析纯(上海国药集团化学试剂有限公司),碳化二亚胺盐酸盐EDC·HCl(上海品纯试剂有限公司),明胶和核固红染料(武汉博士德公司),标准铁溶液(GBW08616,1 000 μg/ml)(北京国家标准物质研究中心),亚铁氰化钾分析纯(天津市化学试剂三厂),胰酶、EDTA(美国Amresco 公司)。
1.2 主要设备
光学显微镜(日本Olympus 公司),免疫荧光显微镜(同济医院公共实验室),磁性分离器(台湾先进纳米科技股份有限公司),4.7 T/30 cm 小动物磁共振成像仪(德国Bruker Biospec 公司),普通细胞培养箱(美国科俊仪器有限公司),JP-C50 型超声波振荡仪(广州市吉普超声波电子设备有限公司),JI80-2 型台式离心机(武汉市首义医疗器械厂),HPIAS21000 型全自动医学彩色图像分析系统(武汉华中科技大学同济医学院病理教研室)。
1.3 方法
1.3.1 EGFR 靶向性MRI 探针的制备 将萘、钾和丙烯醇溶解于四氢呋喃溶液,然后加入环氧乙烷及正己烷,利用阴离子开环聚合反应合成一端为烯丙基另一端为羟基的聚乙二醇(Allyl-PEG-OH),通过烯丙基聚乙二醇的羟基端引发己内酯开环聚合为烯丙基聚乙二醇聚己内酯共聚物(Allyl-PEG-PCl),利用烯丙基和2-氨基乙基硫醇盐酸盐的水相加成将烯丙基转化为氨基,得到α-氨基聚乙二醇聚己内酯共聚物(NH2-PEGPCl),用叶酸修饰得到叶酸功能化的聚乙二醇聚己内酯共聚物(Fa-PEG-PCl)[7]。合成疏水型Fe3O4纳米粒子(SPION),将疏水型Fe3O4纳米粒子表面改性,制备亲水 型Fe3O4纳米粒子(WSPIO),加入阿霉素(2mg/ml)376μl 混匀,后加入7.52mg EDC·HCl,然后采用溶剂挥发法制备负载超顺磁性氧化铁(SPIO)的聚合物胶束,得到表面亲水、内部疏水的EGFR 靶向性MRI 探针。
1.3.2 EGFR 靶向性MRI 探针理化特性的分析 探针的表征包括:粒径、SPIO 和阿霉素(Doxorubicin, DOX)负载率、弛豫率。应用透射电子显微镜(trans-mission electron microscope, TEM)测量探针的粒径,采用原子吸收法测定SPIO 的含量,将已知重量的SPIO 分散到1 mol/L HCl 溶液中,使SPIO 分解为铁离子并溶解在溶液中,根据已经建立的标准曲线,测定280 nm处的吸收 得到DOX 的负载,测定248.3 nm 处的吸收,计算出铁含量,用氧化铁的质量除以胶束的总质量,得到SPIO 的负载率。通过MR 扫描仪行常规T2和T2maping 序列成像,扫描参数设置:回波时间分别取8.50、17.00、25.50、34.00、42.50、51.00、59.50 及68.00 ms,重复时间1 055 ms,视野10 cm×10 cm,层厚与层间距均为5 mm,矩阵256×256。观察T2信号强度在探针溶液不同浓度(0、0.10、0.30、0.60、0.90、1.80 nmol/L)下的改变情况,获得1/T2值,计算弛豫率。
1.3.3 NSCC 的培养 在37℃、5%二氧化碳CO2饱和湿 度下,采用RPMI 1640 培养液[含青霉素钠(100u/ml)、链霉素(100u/ml)及小牛血清(100μg/m1)]进行NSCC 和正常鼻咽细胞传代培养。
1.3.4 普鲁士蓝染色 将SPIO 浓度分别为5、10、20、40 和80μg/ml 的EGFR 靶向性MRI 探针分别与NSCC 细胞及正常鼻咽细胞(细胞计数5×105个)在RPMI 1640 培养液中共孵育1h,之后用磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤3 次,用4%戊二醛固定10min,采用普鲁士蓝反应液孵育30min,蒸馏水洗3 次,伊红(0.5%)复染3min,显微镜下观察Fe 染色情况[8]。
1.3.5 间接免疫荧光检测 将等量NSCC 细胞接种在24 孔板中,并培养1d。当NSCC 细胞铺满玻片时,采用冰甲醇进行固定,10min 后采用PBS 洗玻片3 次,正常兔血清室温封闭。40min 后,向各玻片分别加入EGFR 靶向性MRI 探针、西妥昔单抗及PBS。置入4℃湿盒1d。次日采用PBS 洗玻片3 次,加入含有FITC标记的兔抗人IgG(避光),室温孵育。采用Hoechst 33258 避光染色,采用PBS 洗玻片3 次,脱水、封片、荧光显微镜观察。
1.3.6 细胞的MRI 肿瘤磁敏感成像 在RPMI 1640培养液中加入EGFR 靶向性MRI 探针(SPIO 分别为0、5、10、20、40 和80 μg/ml)分 别与NSCC 细胞及正常鼻咽细胞孵育1 h,消化、洗涤、重悬细胞,置于1.5ml Ependoff 管中采用MRI 扫描[9]。采用Philips Intera 3T MRI 系统,环形表面线圈(C3 线圈)行轴面及冠状面扫描,T2WI 采用快速自旋回波(FSE)系列,TE 100 ms,TR 1 600 ms,层厚1.5 mm,矩阵384× 512,4 次激励。选择相似的感兴趣区测量6个信号强度,计算信号变化率(△SI),△SI=[(SIL-SIU)/SIU]×100%,SIL 为EGFR 靶向性MRI 探针与细胞共孵育后的信号强度,SIU 为细胞信号强度。
1.4 统计学方法
数据分析采用SPSS 21.0 统计软件。计量资料以均数±标准差(±s)表示,比较采用单因素方差分析,P<0.05 为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 EGFR 靶向性MRI 探针的理化特性
EGFR 靶向性MRI 探针的粒径为(77.0±1.5)nm,SPIO 负载率为(306.0±4.9)μg/ml,DOX 负载率为(103.3±3.1)μg/ml,弛豫率为(110.4±2.9),提示EGFR 靶向性MRI 探针制备成功。见图1、2。
2.2 普鲁士蓝染色结果
EGFR 靶向性MRI 探针与NSCC 细胞共孵育后,细胞内可见不同量的蓝色Fe 颗粒,随着SPIO 浓度的升高而增多;EGFR 靶向性MRI 探针与正常鼻咽细胞共孵育,细胞内未见明显Fe 颗粒存在。见图3。
2.3 EGFR 靶向性MRI 探针对NSCC 细胞的免疫结合活性
西妥昔单抗(阳性对照)在NSCC 细胞膜有强烈的绿色荧光表达,阴性对照呈现很微弱的绿色荧光表达,EGFR 靶向性MRI 探针与西妥昔单抗荧光强度相近。见图4。
图1 EGFR 靶向MRI 探针的TEM 图 (×200)
图2 驰豫曲线
图3 NSCC 细胞内可见不同量的蓝色Fe 颗粒 (普鲁士蓝染色×200)
图4 3 组NSCC 细胞内不同的绿色荧光表达 (Hoechst 33258 染色×200)
2.4 体外MRI
随浓度0、5、10、20、40 和80 mg/ml 梯度升高,EGFR 靶向性MRI 探针T1信号基本无变化,EGFR 靶向性MRI 探针T2信号强度逐渐减弱,EGFR 靶向性MRI 探针在20、40 和80 mg/ml 3个浓度点比较,T2信号强度明显下降,其中80 mg/ml T2信号强度下降最显著(见图5)。EGFR 靶向性MRI 探针与NSCC 细胞共孵育后MRI 信号在T2WI 上有不同程度的减低(P< 0.05),SPIO 浓度越高MRI 信号强度减弱越明显(P< 0.05)。见表1。
图5 体外MRI
表1 不同浓度SPIO 与NSCC 细胞孵育后在T2WI 上信号变化情况比较 (±s)
表1 不同浓度SPIO 与NSCC 细胞孵育后在T2WI 上信号变化情况比较 (±s)
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3 讨论
NSCC 发病机制尚不明确,是临床常见的耳鼻咽喉恶性肿瘤之一[10-12]。临床上,放疗是NSCC 治疗的主要手段。研究表明,单纯放疗治疗各期NSCC 的5年总生存率可达70%。为此,制定合理的放疗靶区是提高NSCC 治愈率的关键因素。MRI 具有良好的软组织对比性及空间分辨率,能较好地诊断NSCC,但常规的MRI 常用的造影剂钆(Gd-DTPA)未分布在特殊的靶向器官,只对T1信号增强,并未能显示亚临床病灶。USPIO 是一种粒径小、具有超顺磁性、敏感性高、毒性低和生物可降解的新型磁性纳米生物材料,常用于恶性肿瘤的影像诊断中。相关研究表明,NSCC 的EGFR 表达水平≥85%[13]。EGFR 是一种已知分子量为170~180 kD 的糖蛋白单体,其与配基结合后,可提高络氨酸激酶活性,从而吸引具有SH2 区域的信号分子,进而启动细胞分裂、信号传递、DNA 复制、基因转录等一系列变化,具有促进细胞增殖、黏附、侵袭及其转移,进而诱导形成肿瘤的作用[14]。因此,制备EGFR 靶向性MRI 探针对高表达EGFR 的NSCC 进行MRI 免疫显像理论上是可行的。
本研究自行制备EGFR 靶向性MRI 探针,观察其对EGFR 表达阳性的NSCC 细胞的主动靶向作用,即配体介导、位点特异性的纳米复合物在肿瘤细胞中的聚集,探讨靶向性。将不同浓度SPIO 的EGFR 靶向性MRI 探针与NSCC 细胞孵育,通过普鲁士蓝染色、间接免疫荧光和MRI 观察NSCC 细胞对EGFR 靶向性MRI 探针的摄取情况,结果显示,普鲁士蓝染色证实EGFR 靶向性MRI 探针对NSCC 细胞的靶向摄取依赖于SPIO 浓度,西妥昔单抗(阳性对照)在NSCC细胞膜有强烈的绿色荧光表达,阴性对照呈现很微弱的绿色荧光表达,提示阳性对照NSCC 细胞膜EGFR高表达,阴性对照是非特异性结合导致;EGFR 靶向性MRI 探针细胞膜有强烈的绿色荧光表达,EGFR 靶向性MRI 探针组与西妥昔单抗荧光强度相近,说明EGFR 靶向性MRI 探针有良好的免疫活性和结合活性,EGFR 靶向性MRI 探针可特异性结合进入NSCC细胞内,从而降低MRI T2信号强度。
综上所述,EGFR 靶向性MRI 探针的粒径小,可降低MRI 的T2信号强度,具有高度的靶向性。EGFR靶向性MRI 探针为NSCC 的早期准确诊断和治疗提供新的思路和技术,其NSCC 体内示踪有利于复发、转移病灶的早期检出,可在准确诊断的同时进行联合化疗,值得推广。