毛士明，曹金强，汪万国，郑灿

(枝江市人民医院 神经内科，湖北 枝江 443200)

再灌注损伤是缺血性脑卒中治疗过程中的一个难题，深入探讨缺血再灌注(ischemia-reperfusion，IR)损伤的机制对其治疗有重要意义。微小RNA(microRNA，miRNA)是一类长度19～22个核苷酸的非编码RNA，可以与信使RNA的3′端非翻译区结合，介导转录后基因调控[1]。miRNA广泛表达于人体各个组织和器官，在细胞增殖和分化、细胞周期、表观遗传学和免疫监控中起到重要作用[1]。miR-30e与机体免疫炎症损伤密切相关[2]，可通过调控凋亡基因Bcl-2影响脑缺血后神经细胞损伤[3]。有研究发现，miR-30e可以通过改善自噬对心脏IR损伤有一定保护作用[4]。miR-30e在脑IR损伤中的作用和机制既往鲜有报道。5-脂氧合酶(5-lipoxygenase，5-LOX)是白三烯生物合成的关键酶，与中枢神经系统炎症性疾病有关[5]。5-LOX过表达可促进促炎细胞因子的产生，导致脑IR损伤后神经元损伤[6]。本研究采用生物信息学和双荧光素酶报告基因技术分析miR-30e与5-LOX的靶向作用关系，通过大鼠实验探讨miR-30e在脑IR损伤中的作用机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试剂与仪器 miR-30e 激动剂(miR-30e agomir)、miR-30e 激动剂对照试剂、miR-30e 拮抗剂(miR-30e antagomir)、miR-30e 拮抗剂对照试剂、miR-30e模拟物、miR-30e抑制剂和5-LOX siRNA均购于上海吉玛制药技术有限公司；2，3，5-氯化三苯基四氮唑购于上海碧云天生物技术有限公司；TRIzol试剂、反转录试剂盒和2倍SYBR Green PCR Mastermix试剂盒均购于美国Sigma公司；BCA蛋白提取试剂盒和SDS-PAGE凝胶快速制备试剂盒均购于北京百奥莱博科技有限公司；5-LOX抗体和羊抗兔抗体购于美国Sigma公司；酶联免疫吸附实验试剂盒购于武汉博士德生物有限公司；二甲基亚砜、噻唑兰(MTT)检测试剂盒购于美国Sigma公司。主要仪器有脑立体定位仪(型号51700，美国Stoelting公司)、全自动发光仪(型号ACCESS2，美国贝克曼库尔特公司)、酶标仪(型号SAF-680T，上海旦鼎国际贸易有限公司)、流式细胞仪(型号FACSCalibur，美国BD公司)。

1.1.2 细胞 PC12细胞购于上海复祥生物科技有限公司，用含有10%胎牛血清的 RPMI 1640 培养基，置于 37 ℃、5%CO2培养箱中培养。当细胞融合度达90%时，倒掉培养液，用0.125%胰蛋白酶消化细胞后1 000 r·min-1离心10 min，用细胞培养液悬浮细胞，接种于培养基中继续培养。

1.1.3 实验动物 成年雄性SD大鼠70只，体重250～300 g，购于北京维通利华实验动物公司，合格证号SCXK(京)2012-003。将大鼠在温度为(21±1)℃、湿度为(50±5)%、明暗周期为12 h/12 h的环境中饲养，允许自由摄食和饮水。

1.2 大鼠脑IR损伤模型的建立

参照文献[7]方法建立大脑中动脉闭塞再灌注模型。用100 g·L-1水合氯醛溶液(3 ml·kg-1)腹腔注射麻醉后分离颈总动脉分叉、颈外动脉、颈内动脉，结扎颈外动脉和颈总动脉近心端，随后用动脉夹夹闭颈总动脉远心端。在颈总动脉分叉上2 mm处开一小口，将尼龙线栓缓慢插入颈总动脉，调整头端方向，感觉有突破感时说明进入颅内。继续推进20 mm，感到有阻力时停止。将颈内动脉远心端的预留线系紧，剪去线头。术毕逐层缝合皮肤。缺血2 h后拔出线栓，若大鼠出现明显的局灶神经功能缺损例如一侧倾倒，说明造模成功。本研究大鼠均造模成功。

1.3 大鼠分组及干预

将大鼠随机分为7组各10只：(1) 假手术组，仅做颈部切口，无IR损伤;(2) 模型组，建立脑IR损伤模型；(3) 载体组，建立IR损伤模型，用焦碳酸二乙酯(diethyl pyrocarbonate，DEPC)处理水干预；(4) miR-30e激动剂组，建立IR损伤模型，用miR-30e激动剂干预；(5) 激动剂对照组，建立IR损伤模型，用激动剂对照试剂干预；(6) miR-30e拮抗剂组，建立IR损伤模型，用miR-30e拮抗剂干预；(7) 拮抗剂对照组，建立IR损伤模型，用拮抗剂对照试剂干预。3～7组大鼠均进行侧脑室注射(前囟后1 mm，向右旁1.4 mm，硬脑膜下4.0 mm[8])，将miR-30e激动剂、激动剂对照试剂、miR-30e拮抗剂、拮抗剂对照试剂溶于DEPC处理水中，稀释至100 μmol·L-1，注射体积为10 μl。干预24 h后进行神经功能评分：无明显神经功能缺损为0分，提尾巴时动物左前肢屈曲不能伸直为1分，行走时向左侧转圈、静息时可维持平衡为2分，行走时向偏瘫侧倾倒为3分，无可见活动为4分[9]。评估结束后处死大鼠。

1.4 大鼠脑梗死体积检测

处死大鼠后迅速取脑，用切片机切成5个冠状切片，厚度约2 mm。用2%的2，3，5-氯化三苯基四氮唑染色30 min，然后浸泡于4%多聚甲醛过夜。梗死组织为白色，正常脑组织为红色。梗死体积(%)=缺血区重量/总重量。

1.5 实时定量-聚合酶链反应(RT-PCR)

用TRIzol试剂和反转录试剂盒提取大鼠皮质梗死周围区组织中的总RNA，随后反转录为cDNA。使用2倍SYBR Green PCR Mastermix试剂盒检测miR-30e与5-LOX mRNA的相对表达量。PCR反应条件为：95 ℃ 20 s、95 ℃ 10 s、60 ℃、20 s，共40个循环。用2-ΔΔCq法计算基因相对表达量。

1.6 蛋白质印迹实验

用RAPI裂解液提取大鼠皮质梗死周围区组织中总蛋白，用BCA试剂盒检测蛋白浓度，10%SDS-PAGE分离蛋白，用半干转移法将蛋白转至PVDF膜。5%脱脂奶粉封闭2 h，加入抗5-LOX(1∶1 000)4 ℃过夜孵育，第2天除去一抗，用TBST缓冲液洗涤3次后加入二抗(羊抗兔，1∶500)，封闭1 h。以β-肌动蛋白作为内参，用ECL发光仪对蛋白成像，Image J软件分析灰度值。

1.7 酶联免疫吸附试验

操作步骤严格按照试剂盒说明书进行，酶标仪在450 nm波长下检测半胱氨酸白三烯(cysteinylleukotrienes，CysLT)和白三烯B4(leukotriene B4，LTB4)的OD值，绘制标准曲线后计算浓度。

1.8 双荧光素酶报告实验

应用Targetscan和MiRDB软件预测miR-30e和5-LOX的结合位点。构建野生型(psiCHECKTM-2-5-LOX-wt)和突变型(psiCHECKTM-2-5-LOX-mut)报告载体，转染至293T细胞中，再用miR-30e 模拟物或抑制剂进行干预。实验分为以下7组：(1) 仅将空载体组转染至293T细胞中，设为psiCHECKTM-2组；(2) 将 阴性对照序列转染入含有野生型空载体的293T细胞中，设为5-LOX-Wt+NC组；(3) 野生型报告载体转入293T细胞中，用miR-30e 模拟物干预，设为5-LOX-Wt+mimic组；(4) 野生型报告载体转入293T细胞中，用miR-30e 抑制剂干预，设为5-LOX-Wt+inhibitor组；(5) 将阴性对照序列转染入含有突变型空载体的293T细胞中，设为5-LOX-Mut+NC组；(6) 将突变型报告载体转入293T细胞中，用miR-30e 模拟物干预，设为5-LOX-Mut+mimic组；(7) 将突变型报告载体转入293T细胞中，用miR-30e抑制剂干预，设为5-LOX-Mut+inhibitor组。psiCHECKTM-2载体能同时表达肾素荧光素酶和萤火虫荧光素酶。miR-30e与5-LOX-Wt载体的结合作用可降低肾素荧光素酶，而非萤火虫荧光素酶的表达。细胞转染24 h后收集细胞，用PromegaE1910双萤光素酶报告基因检测系统测定萤火虫和肾素荧光素酶的活性。

1.9 细胞缺氧复氧损伤模型建立及干预

转染mimic或inhibitor后，建立缺氧-葡萄糖剥夺和复氧(oxygen glucose deprivation and reoxygenation，OGDR)损伤模型。将PC12细胞在缺氧(1%O2、94%N2和5%CO2)室中培养12 h，随后在正常条件下培养4 h[10]。根据处理条件不同将细胞分为以下几组：(1) 常 氧组，细胞在正常氧气条件下培养；(2) OGDR组，建立OGDR损伤模型，但不进行干预；(3) mim-miR-NC组，建立OGDR损伤模型，用miR-30e模拟物对照试剂干预；(4) mim-miR-30e组，建立OGDR损伤模型，用30 μmol·L-1miR-30e mimic干预；(5) mim-miR-30e+si-5-LOX组，建立OGDR损伤模型，用30 μmol·L-1miR-30e mimic和2 μmol·L-1si-5-LOX干预；(6) inh-miR-NC组，建立OGDR损伤模型，用miR-30e抑制剂对照试剂进行干预；(7) inh-miR-30e组，建立OGDR损伤模型，用100 nmol·L-1miR-30e inhibitor干预；(8) inh-miR-30e+si-5-LOX组，建立OGDR损伤模型，用100 μmol·L-1miR-30e inhibitor和2 μmol·L-1si-5-LOX干预。

1.10 细胞活力检测

用MTT法检测细胞活力，PC12细胞接种于96孔板，当细胞融合度达80%时进行如1.9中的细胞干预。随后每孔加入20 μl的MTT液，37 ℃条件下孵育4 h，去除原培养基，在每孔中加入二甲基亚砜(150 μl)，用酶标仪检测细胞活力。

1.11 流式细胞检测实验

将细胞接种于96孔板，当细胞融合度达80%时进行如1.9中的细胞干预。加入磷酸盐缓冲液，调整细胞浓度至1×105个·ml-1。 混合后取1 ml细胞悬液，100 r·min-1离心10 min后弃上清，加入碘化丙啶和膜联蛋白Ⅴ-FITC各5 μl，充分混合，室温避光孵育10 min。用流式细胞仪检测细胞凋亡情况。

1.12 统计学处理

采用SPSS 19.0进行统计学分析，多组间比较用单因素方差分析，两两比较用LSD-t检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 miR-30e激动剂或拮抗剂对IR损伤大鼠神经功能和脑梗死的影响

假手术组大鼠无神经功能障碍及脑梗死；其余6组神经功能评分明梗死体积的比较差异有统计学意义(分别F=65.321和F=52.109，均P<0.001)；与激动剂对照组比较，miR-30e激动组神经功能评分明显较低、梗死体积明显较小(均P<0.05)；与拮抗剂对照组比较，miR-30e拮抗剂组神经功能评分明显较高、梗死体积明显较大(均P<0.05)。见图1。

a 与假手术组比较，P<0.05；b 与激动剂对照组比较，P<0.05；c 与拮抗剂对照组比较，P<0.05

2.2 miR-30e激动剂或拮抗剂对IR损伤大鼠5-LOX的影响

7组miR-30e相对表达量和 5-LOX蛋白表达量的比较差异均有统计学意义(分别F=44.240和F=29.002，均P<0.001)；与假手术组比较，模型组大鼠皮质梗死周围区组织miR-30e和5-LOX表达水平明显升高(均P<0.05)；与激动剂对照组比较，miR-30e激动组miR-30e和5-LOX表达水平明显下降(均P<0.05)；与拮抗剂对照组比较，miR-30e拮抗剂组miR-30e和5-LOX表达水平明显升高(均P<0.05)。见图2。

a 与假手术组比较，P<0.05；b 与激动剂对照组比较，P<0.05；c 与拮抗剂对照组比较，P<0.05

2.3 miR-30e激动剂或拮抗剂对IR损伤大鼠炎症因子的影响

7组CysLT和LTB4 表达水平的比较差异均有统计学意义(分别F=23.931和F=30.002，均P<0.001)；与假手术组比较，模型组大鼠皮质梗死周围区组织CysLT和LTB4表达水平明显升高(均P<0.05)；与激动剂对照组比较，miR-30e激动组CysLT和LTB4表达水平明显下降(均P<0.05)；与拮抗剂对照组比较，miR-30e拮抗剂组CysLT和LTB4表达水平明显升高(均P<0.05)。见图3。

a 与假手术组比较，P<0.05；b 与激动剂对照组比较，P<0.05；c 与拮抗剂对照组比较，P<0.05

2.4 双荧光素酶报告实验验证miR-30e对5-LOX的靶向作用关系

用TargetScan在线工具预测到5-LOX是miR-30e的候选靶基因。7组肾素/萤火虫荧光素酶活性比值的比较差异有统计学意义(F=11.234，P=0.001)。与5-LOX-Wt+NC组比较，5-LOX-Wt+mimic组的肾素/萤火虫荧光素酶活性比值明显降低(P<0.05)，5-LOX-Wt+inhibitor组明显升高(P<0.05)。当miR-30e结合位点发生突变时，5-LOX-Mut+mimic组和5-LOX-Mut+inhibitor组的肾素/萤火虫荧光素酶活性比值均保持在较高水平，见图4。以上结果说明，5-LOX是miR-30e的靶基因。

a 与5-LOX-Wt+NC组比较，P<0.05

2.5 miR-30e 模拟物或抑制剂对OGDR损伤细胞5-LOX的影响

6组miR-30e相对表达量和5-LOX蛋白表达水平比较差异均有统计学意义(分别F=11.134和F=9.201，均P<0.01)；与常氧组比较，OGDR组miR-30e和5-LOX表达水平明显升高(均P<0.05)；与mim-miR-NC组比较，mim-miR-30e组miR-30e和5-LOX表达水平明显降低(均P<0.05)；与inh-miR-NC组比较，inh-miR-30e组miR-30e和5-LOX表达水平明显升高(均P<0.05)。见图5。

a 与常氧组比较，P<0.05；b 与mim-miR-NC组比较，P<0.05；c 与inh-miR-NC组比较，P<0.05

2.6 miR-30e模拟物或抑制剂对OGDR损伤细胞的活力和凋亡的影响

8组细胞增殖活力和细胞凋亡率的比较差异均有统计学意义(分别F=10.012和F=15.003，均P<0.001)；与常氧组比较，OGDR组细胞活力明显下降，而凋亡明显增加(均P<0.05)；与mim-miR-NC组比较，mim-miR-30e组和mim-miR-30e+si-5-LOX组细胞活力明显升高，而凋亡明显减少(均P<0.05)；与inh-miR-NC组比较，inh-miR-30e组细胞活力明显下降，而凋亡明显增加，inh-miR-30e+si-5-LOX组细胞活力明显升高，而凋亡明显减少(均P<0.05)。见图6。

a 与常氧组比较，P<0.05；b 与mim-miR-NC组比较，P<0.05；c 与inh-miR-NC组比较，P<0.05

3 讨 论

越来越多的研究证实，miRNA在IR损伤中发挥重要作用[11]。miR-30e是miR-30家族的重要成员之一，与细胞增殖、分化、凋亡、自噬和细胞周期等有关，可参与癌症[12]、糖尿病[13]和心脏病[14]等疾病的发生和发展。本研究发现，miR-30e在大鼠脑IR损伤后皮质梗死周围区中显著升高，并且可能与神经炎症有关。神经炎症时脑IR损伤后常见的病理变化与神经功能缺损密切相关[15]。

miR-30e在炎症损伤中的作用机制尚未明确，可能通过NLRP3 炎症小体[2]、Janus激酶/信号转导与转录激活子信号通路[16]和Notch信号通路[17]等发挥作用。本研究采用生物信息学和双荧光素酶报告基因实验证实5-LOX是miR-30e的靶基因。5-LOX是白三烯生物合成的关键酶，与中枢神经系统炎症性疾病有关[5]。本研究中，脑IR损伤后5-LOX、CysLT和LTB4表达水平明显升高，miR-30e 激动剂明显降低了其表达，而miR-30e 拮抗剂又可以上调其表达，说明miR-30e在脑IR损伤中起到抗炎作用。本研究结果显示，miR-30e 激动剂可减轻脑IR损伤诱发的神经损伤，并缩小梗死面积，而miR-30e 拮抗剂可加重神经损伤，说明miR-30e有神经保护作用，本研究体外研究也予以证实。体外研究显示，miR-30e可以促进神经细胞活性并抑制细胞凋亡。

为了进一步证实miR-30e与5-LOX的关系，我们用siRNA下调PC12细胞中5-LOX的表达。研究发现，siRNA可以缓解miR-30e抑制剂对细胞的损伤，而miR-30e模拟物可以抵消这种作用。miR-30e抑制剂可以抵消miR-30e对5-LOX的抑制作用，加重细胞损伤。然而当用miR-30e 模拟物处理细胞时，虽然5-LOX表达明显下调，但是5-LOX-siRNA并不能降低5-LOX表达，说明5-LOX-siRNA并不能缓解miR-30e模拟物导致的PC12细胞损伤。以上结果说明，5-LOX是miR-30e下游的重要分子。

综上所述，miR-30e对大鼠脑IR损伤和OGDR细胞损伤具有神经保护作用，这种作用可能通过5-LOX进行介导。miR-30e可能是治疗脑IR损伤的潜在靶点。