李 霞 王 姣 河北省邢台市人民医院重症医学科 054000

急性肺损伤(Acute lung injury，ALI)/急性呼吸窘迫综合征(Acute respiratory distresss syndrome,ARDS)是由多种原因引起的肺部过度炎症反应，临床表现为呼吸窘迫、难治性低氧血症。其发病机制尚未完全明确，主要有以下4个学说：交感神经学说、细胞凋亡学说、内毒素学说、肺泡巨噬细胞(AM)学说[1]。交感神经学说认为交感神经兴奋、肾上腺素能受体过度激活，启动了炎症反应的发生发展，造成多系统损害及多器官功能障碍，呼吸系统表现为ALI/ARDS。Zhang等[2]研究表明，应用α2A受体阻断剂，抑制交感神经活性可以减轻内毒素血症的炎症反应。

β受体阻滞剂在心血管学科广泛应用，通过拮抗儿茶酚胺类肾上腺素能递质，阻断肾素血管紧张素醛固酮系统，明显降低冠心病、心功能不全、高血压患者的死亡率。但β受体阻滞剂对急性肺损伤是否具有保护作用，目前国内未见研究。酒石酸美托洛尔(Metoprolol Tartrate)是一种选择性β1受体阻断剂，对β2受体作用较弱，无内在拟交感活性。因此本文通过复制LPS诱导的急性肺损伤小鼠模型，观察酒石酸美托洛尔对炎症因子TNF-α及凋亡蛋白Caspase-3表达的影响，为急性肺损伤治疗提供新的思路。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂 健康雄性昆明小鼠18只，体重28～32g (由河北医科大学动物实验中心提供)，脂多糖(Lipopolysaccharide，LPS，美国sigma公司)、酒石酸美托洛尔(哈药集团生物工程有限公司)；Caspase-3抗体(中国Affinity公司)，TNF-α ELISA试剂盒(上海欣博盛生物科技有限公司)。

1.2 实验分组 实验小鼠随机分为三组，每组6只，小鼠尾静脉注射LPS 10mg/kg复制急性肺损伤小鼠模型，造模成功后2h对照组给予生理盐水，干预组给予酒石酸美托洛尔。(1)对照组(腹腔注射生理盐水0.1ml/20g，q12h)；(2)干预组1(腹腔注射酒石酸美托洛尔2.5mg/kg，0.1ml/20g，q12h)；(3)干预组2(腹腔注射酒石酸美托洛尔5mg/kg，0.1ml/20g，q12h)。48h后颈动脉放血处死小鼠，留取颈动脉血及肺组织标本。

1.3 血清TNF-α水平的测定 留取小鼠颈动脉血，4℃离心，取上清液-80℃保存，血清TNF-α采用ELISA法测定，严格按照说明书操作。

1.4 蛋白质免疫印迹法(Western Blot)测定肺组织凋亡蛋白Caspase-3的表达 小鼠肺组织-80℃保存，提取肺组织总蛋白，BCA法蛋白定量，10%SDS-PAGE蛋白电泳(上样20μg)，转PVDF膜，封闭，加一抗(1∶500)，洗膜后加二抗(1∶1 000)，显影，统计光密度值计算各组蛋白的表达。

1.5 统计学方法 实验结果以均数±标准差表示，通过SPSS16.0统计学软件进行单因素方差分析检验，P≤0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 一般行为学观察 造模后各组小鼠皮毛皱缩，活动及觅食行为减少，轻度气喘，药物干预组小鼠较对照组活动更少。

2.2 血清炎性因子TNF-α的水平 与对照组相比，酒石酸美托洛尔干预组(2.5mg/kg；5mg/kg)明显降低了血清TNF-α水平[(485．35±24)ng/L VS(566．57±16)ng/L；(467．63±20)ng/L VS (566．57±16)ng/L]，P值均≤0.05，差异具有统计学意义。

2.3 Western-blot法检测 Caspase-3蛋白的表达水平 如图1所示，与对照组相比，两种剂量的酒石酸美托洛尔干预明显降低了凋亡蛋白Caspase-3的表达，差异有明显的统计学意义(P≤0.05)，提示酒石酸美托洛尔干预能够减少LPS致急性肺损伤小鼠肺组织凋亡蛋白Caspase-3的表达。

3 讨论

急性肺损伤/急性呼吸窘迫综合征(ALI/ARDS)是患者入住重症医学科常见原因，近年随着抗菌药物、小潮气量肺保护通气、俯卧位、ECMO等方法使用明显降低了病死率，但ALI/ARDS仍是危重症患者死亡主要原因[3]。LPS又名脂多糖，是革兰氏阴性杆菌细胞壁上的主要成分，通过激活单核—巨噬细胞，释放多种炎症介质和大量氧自由基等物质诱发急性肺损伤。本研究通过静脉注射LPS建立急性肺损伤小鼠模型，从炎性因子、凋亡蛋白方面发现酒石酸美托洛尔对急性肺损伤具有保护作用，为急性肺损伤治疗提供新的思路。炎症学说是ALI/ARDS发病机制之一[4-5]，肺内源性或肺外源性因素引起的炎症反应，大量的炎性因子释放，如TNF-α、IL-1β、IL-6，触发炎症瀑布效应，导致炎症反应失控，诱导炎细胞浸润，引起弥漫性肺泡损伤，是ALI/ARDS的主要病理生理机制。有学者研究发现β受体阻滞剂能减少严重感染和感染性体克患者的炎性细胞因子产生，减轻多脏器功能衰竭，从而降低住院病死率[6]。本研究通过复制LPS急性肺损伤小鼠模型，发现酒石酸美托洛尔能降低LPS致急性肺损伤小鼠血清炎性因子TNF-α的水平，提示酒石酸美托洛尔具有抗炎作用，但其具体作用部位、作用机制不明。同时研究中观察了肺组织的HE染色，但各组中病理切片炎细胞浸润未见明显差别，可能原因肺组织病变不均一，切片选取部位有关。

图1 酒石酸美托洛尔对肺组织Caspase-3表达的影响注：凋亡蛋白Caspase-3及内参GAPDH的表达，A:对照组(LPS+生理盐水)，B：干预组1(LPS+酒石酸美托洛尔2.5mg/kg)，C：干预组2(LPS+酒石酸美托洛尔5mg/kg)，与对照组相比，酒石酸美托洛尔干预组明显降低了Caspase-3的表达，P ≤0.05。

ALI/ARDS的凋亡学说认为炎症反应、氧化应激导致肺组织凋亡信号过度表达，抑制凋亡因子表达相对不足，导致肺组织进行性损伤凋亡，肺泡组织结构遭到破坏，临床出现严重的低氧血症，呼吸衰竭。Caspase家族与细胞凋亡密切相关，Caspase-3是其家族中最重要的一员，是凋亡发生多条路径的最终执行者，它的激活直接导致细胞凋亡，本研究发现酒石酸美托洛尔下调LPS诱导的急性肺损伤小鼠肺组织caspase-3的表达，从而使肺组织细胞凋亡率下降，对LPS致急性肺损伤小鼠起到保护作用。

总之，本研究发现酒石酸美托洛尔能够减少LPS致急性肺损伤小鼠血清炎性因子TNF-α水平及肺组织凋亡蛋白Caspase-3的表达，但其具体作用机制还不清楚，有研究表明交感神经兴奋启动了脓毒症全身炎症反应的发生和失控[2]，酒石酸美托洛尔是β受体阻断剂，可能通过拮抗交感神经的作用发挥抗炎及减轻凋亡作用，进一步研究可从动物及细胞水平探讨其可能的机制。