余 偲,张宝善,李 娜,刘 巧,李爱萍,孙聿珩,毛伟文,赵 育

(陕西师范大学食品工程与营养科学学院,陕西西安 710119)

啤酒作为一种古老的酒精饮料,已经成为人们日常生活中最普遍最受欢迎的饮品。据相关部门统计,我国啤酒年产量在2013年达到峰值5062万千升,其后逐年下降;2017年,我国人均啤酒消费量为31.9升。啤酒通常被认为是一种生物稳定性较高的饮料,因为含有一系列不利于微生物生长的抑制因子,包括啤酒花苦味酸(约为17～55 ppm),酒精(0.5%～10%,w/w),高浓度的二氧化碳(约为0.5,w/v),低pH(pH3.8～4.7),低溶氧量和极低的营养物质[1]。然而,一些微生物仍能在啤酒中生长繁殖,使啤酒腐败变质[2],这些微生物被称为啤酒腐败微生物或啤酒腐败菌(beer spoilage microorganisms)。迄今为止,已经被发现的啤酒腐败菌达50多种,主要包括:乳酸菌(lactic acid bacteria)、果胶杆菌属(Pectinatus)、巨型球菌属(Megasphaera)和野生酵母(wild yeast)等[3]。其中,革兰氏阳性乳酸菌为最主要的啤酒腐败微生物,它能够耐受啤酒花的胁迫,导致啤酒变粘、浑浊、产酸,同时产生不愉悦的风味,影响啤酒的品质,产生的生物胺等有害物质还可能威胁消费者的健康,给啤酒厂带来巨大的经济损失[4];因此,必须及时检测啤酒厂的腐败菌,并采取相应措施进行控制,以保证啤酒的质量和安全。

表1 啤酒腐败菌检测培养基Table 1 Culture medium for detection of beer spoilage microorganisms

注:LAB：乳酸菌;G(-):革兰氏阴性菌。

然而,对于这些腐败菌,尤其是腐败乳酸菌的检测一直以来都是啤酒工业的一大难题,也是研究人员研究的重点。本文从方法、原理、优缺点等多个方面阐述了近年来国内外对啤酒腐败菌的检测方法,以期为啤酒生产过程中腐败菌的检测提供参考。

1 培养基检测法

1.1 传统培养基检测法

传统的培养基检测法是将待检的样品接种到固体或液体选择培养基中培养,根据固体培养基上是否有菌落的生成或者液体培养基是否变浑浊,来检测啤酒中的腐败菌污染情况[5]。

国内外研究人员已经研发出了众多选择性培养基,用于啤酒腐败菌的检测(表1)[1，7]。尽管对于林氏乳杆菌(L.lindneri)和类丘状乳杆菌(L.paracollinoides)这类在培养基上不易生长的菌株[6],Suzuki等[7]研发出了一种模拟啤酒环境的ABD(advanced beer detection)培养基,然而至今为止仍未发现适合所有啤酒腐败菌生长培养基,且检测这类菌株也耗时较长。为缩短传统培养基法的检测时间,Deng等[8]在MRS(de man,rogosa and sharpemedium)中添加过氧化氢酶,以提高腐败微生物的生长速度和菌落大小,结果表明,改良后的培养基能够较快速的检测出耐酸乳杆菌(L.acetotolerans),包括一些生长缓慢的腐败菌在5 d之内均被检测出来。

目前,传统培养基法仍是啤酒厂检测腐败菌最主要的方法,由于具有操作简单、准确率高、使用仪器少和前期投资成本低,不受啤酒企业规模的限制的优点,使该检测方法一直被广泛沿用。但它的缺点是非常耗时,且实验步骤繁锁,需要花费大量的人力[5],专一性比较差。

1.2 微菌落法

由于传统的培养基检测方法耗费大量的时间和人力,近年来,研究人员通过微菌落法来快速检测啤酒中的腐败菌。该法是将单细胞培养到微小菌落阶段(未能用肉眼观察到时),利用显微成像技术捕捉细胞生长的一种方法[9]。Asano等[10]建立了一种结合荧光探针羧基二乙酸酯(CFDA)染色的微菌落法来检测啤酒腐败菌,结果表明,荧光微菌落技术检测L.brevis需20 h、L.lindneri需62 h左右、L.paracollinoides需40 h左右,相比于传统培养基法检测L.brevis需3 d、L.lindneri需5 d、L.paracollinoides需4～5 d,节省了大量时间;Zhao等[11]利用微菌落法对用消毒剂处理后的短乳杆菌(L.brevis)进行检测,其检测时间缩短至2 d,此外,结合荧光染液PI染色,可以观察到死细胞在微菌落中的分布情况。

微菌落法能够对啤酒腐败菌进行快速、准确的检测,其实验周期短、灵敏度高、特异性好[9]。结合特定的荧光染液,还可以监测到单细胞间的差异。但相对于传统的培养基法它的缺点是需要配备荧光显微镜,使检测成本增加。

2 生物、化学发光检测法

2.1 三磷酸腺苷(adenosine triphosphate,ATP)生物发光检测法

ATP生物发光法先是由萤火虫萤光素和ATP反应形成萤火虫荧光素腺苷酸和磷酸,然后萤火虫荧光素腺苷酸和氧反应,最终形成氧化荧光素和腺苷单磷酸,同时释放出焦磷酸(pyrophosphoric acid,PPi)的过程[12];在这一过程中氧化荧光素成为电子激发态,释放光子,发射出可见的黄绿光[13]。但该方法测定的荧光强度和菌落形成单位(colony forming unit,CFU)之间没有直接关系,一是因为每种菌的ATP含量不同,所检测到的荧光强度中可能还含有酵母和其他非生物的ATP,不只是一种菌中ATP的总量;二是CFU中一个菌落可能是由好几个细胞形成的,这就使得推算出的腐败菌数量与实际不符。此外,该方法不适用于检测含有酵母的啤酒发酵液,也无法对微生物的种属进行鉴定[14],但是能够在短时间内完成对啤酒腐败菌的快速检测。

ATP生物发光检测方法的最大优点是操作简便、快速和测定范围广,能够满足清酒和成品啤酒中菌落总数的快速检测。但需要样品中的细菌浓度(检出限)高于103CFU/mL,所以在检测之前通常需要富集培养;同时,该方法易受外界环境干扰,使检测结果出现假阳性,也不能鉴定微生物种类等的缺点[15]。其反应原理如图1[13]所示:

图1 ATP与荧光素酶的发光反应Fig.1 Luminescence reaction of ATP and luciferase

2.2 氧化还原反应检测法

氧化还原反应检测是以多种细胞脱氢酶辅助因子NADH2的存在为基础,通过检测微生物细胞中NAD/NADH和NADP/NADPH氧化还原反应的一种化学发光法。Preissler等[16]发现可以通过刃天青由氧化型(蓝色)变为还原型(粉色)来指示啤酒腐败菌的氧化还原代谢反应,以检测腐败菌的存在和生长。结果显示,使用刃天青作为脱氢酶活性的指示剂能够在2 d内区分腐败菌株和非腐败菌株。此方法检测时间较短,操作方便且价格低廉,同时可以检测具有难以培养状态的菌株,但对所用培养基的pH范围有一定要求(pH>5.5),使得检测具有局限性[17]。

3 基于聚合酶链式反应(Polymerase chain reaction,PCR)的检测法

PCR技术是一种用特异性引物通过PCR仪扩增特定DNA片段的方法。该方法在6～10 h内便能完成对腐败菌的测定,加上富集菌体,在2 d之内便可完成检测。除此之外,该方法具有检测灵敏度高、速度快和专一性强等优点[18]。但缺点是不能区分腐败、非腐败菌株[19];同时也无法区分死、活菌株,所以会导致检测结果易出现较高的假阳性。但马艳琳等[20-21]通过将叠氮溴乙锭(ethidium bromide monoazide,EMA)或叠氮溴丙锭(propidiummonoazide,PMA)与PCR技术相结合来检测啤酒中的腐败菌,由于EMA和PMA可以和死细胞的DNA形成共价化合物,从而使死细胞的DNA不被扩增,使检测结果更加准确。

随着PCR技术的不断发展,各种基于PCR的新技术也被应用于啤酒腐败菌的检测中,如随机扩增多态性DNA的PCR(RAPD-PCR)、实时定量PCR(real-time PCR)、多重聚合酶链反应(multiplex PCR)和反转录PCR(reverse transcription PCR)等。除此之外,近年来,许多学者发现啤酒腐败菌中含有与菌种无关的抗啤酒花基因,这些基因通过单独或多重组合存在,具有腐败啤酒的能力。Zhao[19]总结了horA、horB、horC、hitA、bsrA、bsrB、arsR、cinA、fabZ等主要啤酒腐败标记基因,日本和加拿大的研究人员通过设计特异性引物对上述一系列标记基因进行检测,也成功检测并鉴定出4种啤酒腐败菌,结果显示该方法灵敏度和准确度高且假阳性低[22-23]。Yin等[24]以horA为靶点,建立基于horA基因介导滚动圆放大的啤酒腐败乳酸菌快速检测方法,具有灵敏度高、专一性好、操作简单,还能降低检测成本的优点。因此,这种不依赖菌种特性、基于标记基因的PCR检测方法近年来成为快速检测啤酒腐败菌的主要方法之一。然而,啤酒腐败标记基因的数量和作用一直存在分歧和争议。有研究报道,horA、horC和hitA等并非存在于每一个腐败菌中,且即使存在,那些菌株也未必具有在啤酒中生长的能力[25-26]。所以,基于标记基因的PCR检测技术不能完全准确的判断菌株是否为啤酒腐败微生物。但随着全基因组测序技术和比较基因组分析方法的高速发展,通过对越来越多未知啤酒腐败菌进行全基因组测序和比对,一定会有更多的啤酒腐败标记基因被发现,并将用于更全面更准确的检测啤酒腐败菌[27,29]。

环介导的等温扩增(loop mediated isothermal amplification,LAMP)是一种新的核酸扩增技术,具有高灵敏性、高特异性,灵敏性是PCR技术的10倍以上[30]。其操作简单、快速、无需昂贵的仪器设备投资,适合现场快速检测。将LAMP和实时定量PCR联用检测啤酒腐败菌时,能够在1.5 h左右鉴定出啤酒腐败微生物中的短乳杆菌(L.brevis)、林氏乳杆菌(L.lindneri)、有害片球菌(P.damnosus)和果胶杆菌属(Pectinatus)[31],极大提高了对扩增产物检测的灵敏性和特异性。同时该技术还可以与荧光免疫、化学发光、PCR等方法联用,能够降低检测结果的假阳性,具有较强的特异性、灵敏性和简便性,在未来该方法很有可能替代PCR被用来检测啤酒腐败菌。但缺点是它对靶序列和引物长度有很高要求,在引物设计上难度也很大。

4 基于核酸杂交的检测方法

4.1 荧光原位杂交(Fluorescencein situ hybridization,FISH)技术

早在20世纪90年代早期,FISH就被用作一种新的检测和识别微生物的技术,且逐渐变得越来越重要。该方法是基于碱基互补的原则[32],利用核酸分子杂交技术直接探测溶液中或固定在膜上的同源核酸序列[33]。此方法不依赖PCR分子技术,是一种高度特异性的全细胞检测技术。使用时不需要进行富集培养,因此该方法所需检测时间短、灵敏度高、特异性强,同时还可以检测到VBNC状态的菌株[34]。但是,其探针设计比较局限,也易出现假阴性结果[35]。

Asano等[10]通过微菌落法和FISH结合的方法,不仅快速检测到了样品中的腐败菌短乳杆菌(L.brevis)、林氏乳杆菌(L.lindneri)和类丘状乳杆菌(L.paracollinoides),还降低了结果的假阴性。因FISH技术无需进行长时间富集培养,并能在短时间内进行定性和定量检测,能够满足啤酒厂快速检测的要求[36]。因此,基于FISH技术的试剂盒也应运而生,如VIT®-beer kit(vermicon AG,Germany),其荧光探针可特异性结合腐败菌的rRNA,样品处理后只需短短3 h便可定量测定出啤酒中的腐败乳酸菌[13],为啤酒腐败菌提供了一种简单、快速的检测方法。

4.2 寡核苷酸微阵列检测方法

寡核苷酸微阵列又称“DNA芯片”,通过特定的仪器对杂交信号进行高效地检测,来分析目的分子的数量及序列,从而确定检测样品中存在的微生物种类和数量[37]。Weber等[38]把16S～23S rRNA之间的基因间隔区(ISR)作为靶标来检测活菌,再结合逆转录酶,将ISR进行PCR扩增,通过寡核苷酸微阵列来鉴定啤酒腐败菌。Cimaglia等[39]也表明用微阵列法可检测啤酒中腐败的酵母、乳酸菌、醋酸菌,并且在很低的浓度(104CFU/mL)就能检测到,灵敏性更高。

寡核苷酸微阵列方法最突出的特点就是能够检测和识别复杂微生物群落的样品中单一的细菌种类,并有高通量的特性,可一次性检测多种样品,获得多种基因的差别表达图谱,具有微型化、高效率、低消耗、高灵敏度的优点。然而,由于分析仪器的成本高、结果分析较为复杂等问题,其使用和推广受到一定的限制。

5 基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)

近年来,MALDI-TOF-MS已作为一种高通量工具用于物种水平检测与鉴定[40]。该方法已成功的应用于不同啤酒腐败菌株的鉴定,不但能区分腐败和非腐败菌株[41],还能对其进行物种水平的鉴定,除此之外,该方法也能够迅速检测到啤酒中野生酵母的污染,区别发酵瓶底部和顶部的发酵菌[42]。

该方法主要是根据离子的质量-电荷比(m/z)与离子的飞行时间成正比来分析和检测离子,采集到相关的微生物蛋白质质量指纹图谱[43],再将质谱图中的峰型与已经构建好的数据库中的参考光谱进行比较,以此对微生物进行鉴别[41,44]。由于MALDI-TOF-MS鉴定,是通过检测核糖体蛋白图谱来进行的,因此,它的鉴定结果更为准确和直接[45]。Kern等[41]已成功地利用MALDI-TOF-MS技术对不同短乳杆菌进行鉴定;Turvey等[42]通过对比已建立的参考光谱,用MALDI-TOF-MS技术检测和鉴定啤酒腐败微生物,能够将细菌和真菌进行准确的检测和识别,检测结果具有高的精确度;Vávrová等[46]利用MALDI-TOF-MS方法对啤酒污染物直接鉴定并对腐败菌生物膜进行分析,为检测啤酒中的腐败菌提供了一种可靠的方法;Wieme等[40]采用该技术,从14个变质啤酒中,收集了348种物种进行鉴定,其中327株(94%)菌种被直接鉴定出来,表明该方法具有高效性和高准确性。

将腐败菌进行培养收集通过MALDI-TOF-MS,大约在15 min左右完成检测,证明它是一种快速有效的检测方法,同时灵敏度极高、样品制备简单、非常适合快速、高通量和准确识别腐败菌等[47]。随着标准谱图数据库以及分析方法的逐渐完善,该技术将成为啤酒腐败菌快速检测和鉴定的重要手段,总之,MALDI-TOF-MS被认为是一种很有前途的新技术。但该方法最大的缺点是需要建立完善的细菌检测和鉴定的标准谱图数据库[45],检测前需要富集培养;由于该技术较新,仪器设备的初始投资成本和后续维护费用过高,不适合中小型啤酒厂购买和使用。

6 总结和展望

啤酒一般被认为是生物稳定性较高的饮料,但仍有一些腐败菌可以在啤酒中生长,直接威胁着啤酒的质量和安全。为了减少啤酒厂的经济损失,检测和清除生产过程中的腐败菌尤为重要,同时,这种检测技术需要满足啤酒工业的切实要求,即简单、快速、准确、灵敏度高和成本低。

传统的培养基方法耗时较长,随着显微成像技术和荧光染色技术的不断发展,微菌落检测法更快速,信息量更大。同时,分子生物学技术、生物信息学技术的不断发展,基于PCR和基于核酸杂交检测啤酒腐败菌的技术的不断出现和更新,使得检测时间更短、灵敏度更高。当然,这些新技术还存在一定问题,如使用PCR前仍需要富集菌体,菌种特异性的引物不能区分腐败菌和非腐败菌,标记基因不能完全准确的反映菌株是否具有腐败作用等等;核酸杂交的探针设计较为局限,检测设备要求较高;MALDI-TOF-MS方法更适合于微生物的鉴定,而不是早期啤酒腐败菌的检测。但随着全基因组测序、生物信息学等技术的高速发展,越来越多的标记基因会被发现,探针引物的设计也会越来越科学和全面,检测价格也会越来越低廉,检测结果也会也来越准确。除此之外,一些新的检测方法也在不断的出现,杨超等[48]根据不同腐败菌产生生物胺、有机酸、风味物质的不同,用高效液相进行色谱分析,检测啤酒腐败菌。因此,在当前的啤酒生产检测中,需要根据实际操作条件及环境,选择符合啤酒工厂条件的检测方法进行啤酒腐败菌的诊断,并及时采取相应的消毒等卫生措施,以保证啤酒的质量和安全。