(北部湾大学食品工程学院,钦州市特色果蔬发酵重点实验室, 广西高校北部湾特色海产品资源开发与高值化利用重点实验室,广西钦州 535011)

方格星虫(Sipunculusnudu)又称光裸星虫、沙虫,是广西北部湾海域特色水产品[1]。近年来,方格星虫加工研究集中于活性物质提取[1-2]、酶解肽制备及抗氧化性[3-4]和加工过程中风味变化[5]等方面。由于方格星虫肉及其酶解物中存在泥土腥味而呈现较差感官品质,同时,酶解加重了苦味,影响了其在食品中的应用,因此,利用Maillard反应改善酶解物的感官特性和挥发性风味十分必要[6]。

目前,关于定性定量分析挥发性化合物种类及浓度变化多采用气相色谱-质谱联用技术[7],然而,鉴定单一挥发性化合物的风味特征不能够准确地评价其对整体风味品质的贡献,因为可感知的风味通常是混合的挥发性化合物组成且发生相互作用形成的[8]。例如,Aprea等[8]证实了苹果的感官风味是由不同挥发性风味成分混合形成的,尽管醛类、醇类、酮类等物质分别呈现独特的风味,但当不同挥发性化合物混合时，形成的复合特征气味是区别于它们单独呈现的感官风味;进而,采用分离鉴定单一挥发性风味组分的方法来评价其对整体感官风味的贡献具有一定的局限性。游刚等[9]采用多重变量分析(主成分分析、聚类分析和偏最小二乘回归分析)找出4种糖(葡萄糖、麦芽糖、木糖和阿拉伯胶)与方格星虫酶解物Maillard反应产物的挥发性风味成分差异及其与感官特性相关性,可用于评价不同糖Maillard反应产物对整体风味品质的贡献。因此,多重变量分析适用于探索分析主要挥发性成分与样品和感官品质之间的相关性,从而阐明不同样品的混合组分的风味特征与感官品质的相关性[10]。

在前期研究酶解工艺优化和Maillard反应特性变化(褐变度、pH、色差、总/游离氨基酸、荧光强度)的基础上[11],选择胰蛋白酶制备酶解物,并与半乳糖形成Maillard反应产物,实验进一步采用电子鼻结合顶空固相微萃取-气相色谱-质谱联用(HS-SPME-GC-MS)和定量描述感官分析法探讨方格星虫肉(SN)、酶解物(SNH)和Maillard反应产物(SNHG)的主要挥发性成分和感官特性变化,运用主成分分析和偏最小二乘回归分析找出它们之间潜在的相关性,旨在为改善酶解物的风味品质及其在食品风味添加剂中的应用提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

新鲜方格星虫[体长(10±2) cm,体宽(1±0.5) cm,体质量(9±2) g] 广西钦州东风市场;胰蛋白酶(250 N.F.U/mg) 索莱宝生化试剂有限公司;D-半乳糖(食品级) 浙江一诺生物科技有限公司;1-辛烯-3-醇、十一醛和1,2-二氯苯(纯度>99%) Sigma试剂有限公司。

GC-MS仪 美国Agilent公司;65 μm DVB固相微萃取纤维头 美国Supelco公司;PEN3电子鼻 德国Airsense公司。

1.2 实验方法

1.2.1 样品制备 参考文献[11],将已去内脏、清洗、沥干的方格星虫肉(SN)搅碎,加去离子水(碎肉∶水=1∶5,g/mL)混合,水浴加热(85 ℃,30 min)后冷却至室温,调节pH=7.5,按底物质量的3%加入胰蛋白酶,于50 ℃水浴中酶解120 min。灭酶(95 ℃,10 min),冰浴、冷却至室温,离心(8000 r/min,15 min),收集上清液、冻干,制备酶解物(SNH)。

将冻干粉SNH和半乳糖(冻干粉∶糖=3∶4,m/m)混合溶于去离子水中,调节pH=9.0,于130 ℃反应60 min,制备Maillard反应产物SNHG(7%,w/v),立即冰浴、冷却,于-20 ℃保存备用。同时制备相同浓度的SN匀浆液(7 g方格星虫肉+100 mL去离子水)和酶解物SNH(7 g冻干粉+100 mL去离子水)。

1.2.2 电子鼻测定 参考文献[12],分别取20 mL样品(SN匀浆液,酶解液SNH和SNHG,浓度均为7%,w/v)置于50 mL保鲜膜密封的离心管中,水浴(50 ℃)加热15 min后测定。设定参数为:传感器室流量300 mL/min,测量样品流量300 mL/min,清洗 120 s,测量90 s。传感器名称和敏感物质如下:1(W1C,芳香苯类),2(W5S,氮氧化物),3(W3C,氨类),4(W6S,氢气),5(W5C,烷烃),6(W1S,甲烷),7(W1W,硫化氢类),8(W2S,乙醇),9(W2W,硫化氢),10(W3S,芳香烷烃)。

1.2.3 HS-SPME-GC-MS测定 参考文献[13],HS-SPME条件:分别取5 mL上述样品于10 mL专用瓶中,加入内标1,2-二氯苯甲醇溶液(50 μg/mL),55 ℃磁力搅拌加热20 min后,萃取30 min(250 ℃预老化30 min)。

GC条件:DB-WAX毛细管色谱柱(60 m×0.25 mm,0.25 μm);氦气1.0 mL/min;进样口温度230 ℃;升温程序:40 ℃保持4 min,以5 ℃/min升至230 ℃后保持5 min;采用不分流模式。萃取头解析5 min后取出。

MS条件:电喷雾电离源,电子能量70 eV,离子阱温度150 ℃,GC-MS传输线温度250 ℃,质量扫描范围m/z 45～550,扫描速率0.220 s/scan。

1.2.4 挥发性风味成分的定性与定量 参考文献[7,14]方法定性:采用NIST14.0谱库检索,选取结果匹配度大于80的化合物,并根据相同条件下正构烷烃标准品(C6-C33)保留时间和公式(1)计算化合物的保留指数(Retention Index,RI),与文献报道值进行比对定性。

式(1)

式中:tR(X)-待测化合物的保留时间;tR(Z)-碳原子数为n的正构烷烃保留时间;tR(Z+1)-碳原子数为n+1的正构烷烃保留时间;Z-碳原子数。

定量:采用内标法对挥发性成分进行定量,根据公式(2)计算化合物的浓度。

式(2)

式中:Cx为化合物浓度;Cs为内标物浓度;Ax为化合物的色谱峰面积;As为内标物色谱峰面积。

1.2.5 感官评价 参考文献[6,14],稍作修改。依据GB/T 16291.1-2012方法[15]进行感官评价员的选拔、培训,形成由年龄在30～45岁之间食品专业的5名男性和3名女性组成的定量描述感官分析小组。实验前2 h,评价员充分熟悉样品特性,并经讨论后,确定样品主要贡献特征风味为:焦糖味、芳香味、肉香味、苦味。采用1～9分制评价样品特征风味强度,对照组感官分值设为5分。设置对照组样品如下:焦糖味(2.5 g熔融白糖+80 mL去离子水)、芳香味(5 mmol/L十一醛)、肉香味(2.5 g热脱脂牛胸肉+100 mL去离子水,过滤)、苦味(5 mmol/L咖啡因)。样品溶于质量分数0.5% NaCl中配置成浓度为1%溶液,分别取60 mL样品和60 mL对照组样品置于40 ℃水浴中恒温10 min。采取三位数随机编码样品,同一样品编3个不同号码,保证评价员在三次重复试验中拿到的样品编号不重复,且以随机顺序呈送进行感官评分。

1.3 数据处理

采用Origin 2017软件对三次重复实验数据进行统计分析和多重变量分析(主成分分析和偏最小二乘回归分析,数据预先标准化处理)并作图,显著性水平设为P<0.05。采用WinMuster软件对电子鼻数据进行分析。

2 结果与分析

2.1 电子鼻分析

图1显示了SN、SNH和SNHG的主成分分析结果。第一主成分PC1的贡献率为94.49%,PC1和PC2的总贡献率为99.81%,表明PCA分析能较好地反映原始样品数据信息[15]。SN、SNH和SNHG挥发性化合物响应值没有重叠区域,表明SN经胰蛋白酶酶解及Maillard反应均可明显改变挥发性风味成分,电子鼻PCA方法可有效区分SN、SNH和SNHG的特征风味变化。

图1 电子鼻PCA Fig.1 Principal component analysis of electronic nose

SN、SNH和SNHG的电子鼻Loadings分析如图2所示。Loadings分析可直观地呈现每个传感器对PCA的贡献率。1、3、5和10号传感器位于坐标(0,0)附近,且位置相邻,表明传感器信号变化较弱,对应的风味(芳香苯类、氨类、烷烃、芳香烷烃)贡献率较小。4号传感器在第1主成分上稍有贡献,6、8和9号传感器在第2主成分上贡献率较大,2号传感器在第1主成分上贡献率较大,7号传感器在第1和2主成分上贡献率都较大,表明氮氧化物、硫化物类和醇类挥发性化合物对特征风味变化贡献较大。尽管电子鼻可以区分不同物质的整体风味,但不能解释酶解和Maillard反应如何引起产物整体风味变化、挥发性化合物的种类组成及含量变化,所以有必要进一步采用SPME-GC-MS定性定量分析主要挥发性风味成分及浓度变化,阐明产物的挥发性风味成分变化机制。

图2 电子鼻Loadings分析Fig.2 Loadings analysis of electronic nose注:1～10代表不同传感器。

表1 SN、SNH和SNHG的主要挥发性风味成分组成及含量Table 1 Composition and contents of main volatile flavor components of SN,SNH and SNHG

注:“NA”表示无法确定,“-”表示未检出。

图3 挥发性化合物种类及浓度Fig.3 Types and concentrations of volatile compounds注:同组不同小写字母表示结果差异显著(P<0.05)。

2.2 挥发性风味成分变化

SN、SNH和SNHG的主要挥发性化合物和浓度如表1所示;对应的挥发性化合物种类及浓度如图3所示。SN主要含有17种挥发性化合物,其中醛类2种(156.086 ng/g)、醇类6种(937.855 ng/g)、酮类3种(175.808 ng/g)、烯烃类3种(889.969 ng/g)和其他类3种(2379.273 ng/g)。SN经胰蛋白酶水解(50 ℃,120 min)后,形成SNH的主要挥发性化合物种类减少至12种,其中醛类3种(970.563 ng/g)、吡嗪类2种(870.542 ng/g)、呋喃类1种(37.772 ng/g)、苯类1种(199.695 ng/g)、酯类1种(216.266 ng/g)、噻唑类1种(97.322 ng/g)、酚类1种(197.115 ng/g)和其他类2种(1481.008 ng/g);SNH进一步与半乳糖发生Maillard反应(130 ℃,60 min),形成SNHG的主要挥发性化合物种类增加至23种,其中醛类5种(2766.066 ng/g)、醇类1种(53.194 ng/g)、吡嗪类4种(318.119 ng/g)、呋喃类2种(214.356 ng/g)、烯烃类1种(23.325 ng/g)、苯类4种(91.110 ng/g)、酯类1种(91.247 ng/g)、噻唑类1种(44.124 ng/g)、酚类2种(1116.488 ng/g)和其他类2种(2330.967 ng/g)。酶解作用和Maillard反应均影响产物的挥发性风味成分种类和浓度,特别是醛类、醇类、吡嗪类、呋喃类和酚类等成分。

醛类化合物是由不饱和脂肪酸氧化分解或者Strecker降解形成的,产生较强的果香味、花香味和坚果味等,由于具有较低的感官风味阈值,对产物挥发性风味影响较大[16]。图3结果显示SN经酶解和Maillard反应后,醛类物质浓度显著增加(P<0.05),表现为:SN(156.086 ng/g)

由于饱和醇的风味阈值较高,对整体风味的贡献较小[17]。SN中的醇类和酮类挥发性物质种类多且含量高,特别是壬醇(395.727 ng/g)和癸醇(200.069 ng/g)的浓度较高,赋予一定的果香味和花香味;但经胰蛋白酶水解后,形成的SNH没有检测出醇类和酮类挥发性成分,经Maillard反应后形成的SNHG中也只检测出壬醇,这是因为方格星虫肉中脂肪含量较低[18],酶解后制备的SNH脂肪含量未检出,所以来源于脂肪氧化分解的醇类和酮类化合物在SNH中未检出;然而,在SNHG中形成的壬醇可能源于氨基酸还原[17]。

吡嗪类和呋喃类物质由于具有肉香味、果香味和咖啡香味,且感官风味阈值较低,对样品整体风味贡献较大[19]。SN中未检出吡嗪类和呋喃类挥发性物质成分,经酶解作用后,SNH中检测出2,5-二甲基吡嗪(713.564 ng/g)、2-甲基-5-异丙基吡嗪(156.977 ng/g)和2-戊基呋喃(37.772 ng/g),进一步经Maillard反应后,SNHG中的吡嗪类和呋喃类挥发性物质种类均增加,其中,吡嗪(16.502 ng/g,果香味)、甲基吡嗪(101.415 ng/g,肉香味、果香味)、三甲基吡嗪(29.199 ng/g,炒花生香味)和3-苯基呋喃(173.211 ng/g,肉香味、果香味)仅在SNHG中检测出,结果表明Maillard反应增加了吡嗪类和呋喃类挥发性物质种类。另外,SNH中的2,5-二甲基吡嗪浓度是SNHG的4.17倍,但其2-戊基呋喃(感官阈值约 6 ng/g)浓度低于SNHG,表明酶解和Maillard反应均可改善SN的挥发性风味,但Maillard反应在增加挥发性物质种类方面好于酶解作用。本研究结果与Sun等[19]发现鸡骨水解提取物Maillard反应过程中吡嗪类和呋喃类挥发性风味成分增加一致。

烃类物质由于感官风味阈值较高,所以对样品整体风味贡献较小。SN中检测出3种烯烃类化合物(D-柠檬烯、茴香烯和癸烯),然而,在SNH中未检测出烯烃类化合物,归因于烃类物质主要来源于脂肪酸烷氧自由基的均裂,而SNH中脂肪含量较低。经Maillard反应后,SNHG中只检测出苯乙烯,表明烯烃类物质成分对SNH和SNHG的风味无贡献。另外,Maillard反应可显著增加产物SNHG中的苯类物质种类(见表1),但其总含量低于SNH中仅有的1,2,3,4-四甲基苯的浓度,而在SN中未检出苯类挥发性成分;然而,电子鼻中对芳香苯类物质敏感的1号传感器(W1C)证实了苯类物质对样品整体挥发性风味贡献小。酯类物质具有较高的感官风味阈值,对样品的风味贡献较小,SN中未检出苯类物质成分,在SNH和SNHG中分别检测出肉豆蔻酸异丙酯(216.266 ng/g)和甲酸辛酯(91.247 ng/g),丰富了样品挥发性成分。

噻唑类物质是由含硫类化合物和含氮类化合物相互作用形成的,这类物质风味阈值低,对样品风味贡献较大[20]。SNH和SNHG中分别检测出2-乙酰基噻唑(97.322 ng/g,爆玉米花香气)和苯并噻唑(44.124 ng/g,肉香味),在SN中未检测出噻唑类物质;结果表明酶解和Maillard反应可增加挥发性风味成分和种类。另外,SNHG中检出抗氧化性较强的酚类物质成分,叔丁基对甲酚(577.592 ng/g)和2,4-二叔丁基苯酚(538.896 ng/g),这与文献报道的Maillard反应增强产物的抗氧化结论一致[21]。同时,在SNH中也检测出2,4-二叔丁基苯酚(197.115 ng/g),表明酶解液也具有一定的抗氧化性,与孙雪萍等[22]研究结论一致;然而,在SN中未检出酚类物质成分。

2.3 感官特性变化分析

SN、SNH和SNHG的感官评分如图4所示。Maillard反应产物SNHG的焦糖味、肉香味和芳香味得分最高。SNHG是由SNH和半乳糖在130 ℃反应60 min形成的,高温促进了焦糖化反应和碳水化合物降解,形成一些具有焦糖味特征的挥发性化合物[14],另外,与SN比较,Maillard反应丰富了醛类(2766.066 ng/g)、吡嗪类(318.119 ng/g)和呋喃类(214.356 ng/g)等挥发性风味成分(见表1和图3),增强了芳香味和肉香味[6,16]。苦味得分表现为:SNH>SNHG>SN;因为SN中游离氨基酸较少,所以苦味较轻;SNH中含有大量的氨基酸和肽,其中疏水性氨基酸导致产物呈现较重苦味[23];经Maillard反应后,氨基酸或肽与糖相互作用形成SNHG,游离氨基酸和肽的浓度减少,同时Maillard反应产物具有包埋掩盖苦味的作用[24],进而减轻了SNHG的苦味。Chen等[14]研究发现Maillard反应减弱了蘑菇酶解液苦味,增强了Maillard产物焦糖味和肉香味;Eric等[24]证明了Maillard反应减弱了太阳花蛋白水解液的苦味,增强了产物的焦糖味和肉香味,以上均与本研究结果类似。

图4 感官评分图Fig.4 Sensory scores for SN,SNH and SNHG

2.4 不同样品与挥发性风味成分之间的相关性分析

主成分分析法(PCA)用来研究不同样品(SN、SNH和SNHG)与挥发性风味成分之间的相关性。采用表1数据进行PCA分析,结果如图5所示。第一主成分PC1的贡献率为57.1%,PC1和PC2的总贡献率为99.3%,表明PCA能较好地反映原始高维矩阵数据信息[10]。根据3种样品在图5中的分布位置可知,SN、SNH和SNHG位置分布分散,无重叠,表明它们在风味组成上差异明显,这与电子鼻分析结果一致。SNHG位于PC1的正区域和PC2的负区域,与醛类(3-甲基丁醛、2-甲基丁醛、壬醛、苯乙醛)、吡嗪类(三甲基吡嗪、吡嗪)、3-苯基呋喃、2,4-二叔丁基苯酚、苯并噻唑、苯乙烯等主要挥发性化合物分布的位置紧邻,表明SNHG的挥发性风味与这些化合物呈现较高的相关性,赋予了SNHG一定的焦糖味、肉香味和芳香味;SNH区域与挥发性化合物肉豆蔻酸异丙酯、2-二甲基-5-异丙基吡嗪、萘、1,2,3,4-四甲基苯,2,5-二甲基吡嗪、苯甲醛、2-戊基呋喃、2,4-二叔丁基苯酚位置分布存在偏离,即其挥发性风味与化合物呈现的相关性较低;SN位于PC1和PC2的负区域,表明SN的挥发性风味与癸醛、癸醇、己醇、壬醇、D-柠檬烯、茴香烯、桉油精和对烯丙基茴香醚成分呈现较高的相关性。从挥发性物质与样品之间的相关性可以看出,SNHG的挥发性物质种类,特别是醛类和吡嗪类,明显多于SNH和SN,因此具有较好的风味特征和感官品质。

图5 不同样品(SN、SNH和SNHG) 与挥发性风味成分之间的相关性Fig.5 Correlation between different volatile compounds and samples for SN,SNH and SNHG

2.5 感官特性与挥发性风味成分之间的相关性分析

尽管每种化合物独立存在时具有独特的风味(见表1),但当不同挥发性化合物混合时可形成更加复杂的气味,感官风味源于不同风味特征的挥发性化合物之间相互作用形成的复杂气味[8],因此,可感知的风味特征不是单个组分的风味特征,而是混合挥发性风味成分相互作用形成的复合风味特征,进而单一挥发性化合物的风味特征不能够准确地评价其对整体风味的贡献。采用偏最小二乘回归分析法(PLSR)进一步考察感官特性与挥发性风味成分之间的相关性,建立PLSR模型计算回归系数确定哪些挥发性风味成分对感官特性有贡献[6,14,16]。

图6分别显示了芳香味、肉香味和焦糖味与挥发性风味成分之间的回归系数;苦味主要与产物中的非挥发性物质(例如氨基酸、Maillard肽等)有关[23],而受挥发性化合物的影响较小,因此未考察苦味与挥发性风味成分之间的回归分析。由图6a可知,芳香味主要与2-甲基丁醛、3-甲基丁醛、壬醛、苯乙醛、壬醇、吡嗪、甲基吡嗪、三甲基吡嗪、3-苯基呋喃、苯乙烯、甲酸辛酯、苯并噻唑、叔丁基对甲酚、2,4-二叔丁基苯酚等挥发性风味成分呈现正相关性,此外还与一些回归系数较低的醇类(癸醇、己醇、庚醇、芳樟醇、辛醇)、酮类(3-辛酮、2-甲基-5-(1-甲基乙基)环己酮、(e)-6-,10-二甲基-5,9-十一碳烯-2-酮)、烯烃类(D-柠檬烯、茴香烯、癸烯)和其他类(桉油精、对烯丙基茴香醚)化合物呈现正相关性。由图6b和6c可知,肉香味和焦糖味主要与2-甲基丁醛、3-甲基丁醛、壬醛、苯甲醛、苯乙醛、吡嗪、甲基吡嗪、三甲基吡嗪、2-戊基呋喃、3-苯基呋喃、苯乙烯、甲酸辛酯、苯并噻唑、叔丁基对甲酚和2,4-二叔丁基苯酚等挥发性风味成分呈现正相关性。相关研究[14,16,24]表明呋喃类化合物主要是由糖焦化作用和碳水化合物分解形成,它们对焦糖味具有较强贡献;另外,含硫和含氮类杂环化合物是Maillard反应典型成分,对肉香味具有较强贡献作用。这与Aprea等[8]研究水果挥发性风味时发现苹果香味是由不同风味特征的挥发性风味化合物混合形成的结论一致。

图6 感官特性与挥发性风味成分之间的回归系数图Fig.6 Regression coefficient between sensory characteristics and valatile flavor components

3 结论

采用电子鼻结合顶空固相微萃取-气相色谱-质谱联用和定量描述感官分析法，探究方格星虫酶解物-半乳糖Maillard反应前后产物挥发性风味成分和感官特性变化及其相关性。结果表明,电子鼻可区分方格星虫、酶解物和Maillard反应产物的挥发性特征风味;方格星虫经酶解和Maillard反应后,产物的主要挥发性化合物种类增加,特别是醛类和吡嗪类,增强了芳香味、肉香味和焦糖味,同时减弱了苦味和泥土腥味,改善了产物的感官特性;且具有抗氧化性的酚类物质浓度增大。进一步分析发现,方格星虫主要挥发性风味与癸醛、癸醇、己醇、壬醇、D-柠檬烯、茴香烯、桉油精和对烯丙基茴香醚等相关;经酶解和Maillard反应后,产物挥发性风味主要与醛类(3-甲基丁醛、2-甲基丁醛、壬醛、苯乙醛)、吡嗪类(三甲基吡嗪、吡嗪)、3-苯基呋喃、2-戊基呋喃、2,4-二叔丁基苯酚、苯并噻唑、苯乙烯等呈现显著的相关性,这些挥发性化合物与芳香味、肉香味和焦糖味呈现正相关性。因此,通过酶解和Maillard反应能够增加产物的挥发性化合物种类和浓度,形成特有的挥发性风味,有利于其在食品风味添加剂中的应用。后续实验将进一步研究不同分子量的酶解肽对Maillard反应特性及其产物挥发性风味成分的影响,为其在食品风味添加剂中的应用提供理论参考。