杨洁 郑凤龙 任喜尚

(郑州澍青医学高等专科学校临床医学系，河南 郑州 450064)

小细胞肺癌(SCLC)多发于重度抽烟人群，其发病率在世界范围内呈不断上升趋势，严重威胁人类的生命健康〔1〕。临床多见非NSCLC和小细胞肺癌这两种肺癌类型，其中NSCLC约占20%。NSCLC恶性程度高、容易转移、预后较差，约2/3患者就诊时已进入广泛期〔2,3〕。目前的治疗手段主要包括手术、放疗、化疗等，但治疗效果并不理想。因此，亟待找寻有效的治疗方法。肿瘤坏死因子(TNF)-α来源于内皮细胞或活化的巨噬细胞，是一种具有多种生物学功能的多肽调节因子，在人体免疫过程中发挥重要作用，但过量的TNF-α则会对人体造成损伤，破坏免疫平衡，诱导炎症发生〔4〕。葛根素(SP)是从传统中药葛根根部提取的一种异黄酮-C-葡萄糖苷，药用价值很大〔5〕。有研究表明SP具有抗癌活性，可降低肿瘤细胞活力并激活Caspase-3诱导结肠癌细胞凋亡〔6〕。另有研究SP可通过减少Wnt/β-catenin信号通路活化抑制宫颈癌细胞增殖、诱导凋亡〔7〕。基质金属蛋白酶(MMP)-2和MMP-9同属于MMPs家族，均可扰乱肿瘤微环境平衡，促进肿瘤细胞的侵袭、转移，与肿瘤侵袭密切相关〔8〕。本研究探究SP对人炎性因子TNF-α诱导的SCLC细胞迁移和侵袭促进作用的影响及作用机制。

1 材料与方法

1.1材料

1.1.1细胞 H446细胞购自北京北纳创联生物技术研究院，编号为BNCC100065。

1.1.2主要试剂 RPMI1640培养液，胎牛血清(FBS)和SP单体(美国Gibco-BRL公司，批号分别为SH30809、10099-141和110752-201318)；胰蛋白酶(美国Hyclone公司，批号为J140028)；TNF-α(美国Peprotech公司，批号为300-01A)；Transwell小室和Matrigel基质胶(美国BD公司，批号分别为2500659和354238)；Trizlol reagent(美国Ambion公司，批号为15596026)；反转录试剂盒和PCR试剂盒(日本Takara公司，批号分别为RR047A和RR02MA)；引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成；全蛋白提取试剂盒，二喹啉甲酸(BCA)蛋白定量试剂盒(北京索莱宝科技有限公司，批号分别为BC3711和PC0020)；鼠抗MMP-2，鼠抗MMP-9和鼠抗β-actin(美国Santa Cruz公司，批号分别为sc-13594、sc-21733和sc-58673)；羊抗鼠二抗(普利莱基因技术公司，批号为C1059)；CCK-8试剂盒(日本同仁化学研究所，批号为CK04)。

1.1.3主要仪器 MCO-18AC型CO2培养箱(日本SANYO公司)；Nanodrop2000型超微量分光光度计(美国Thermo公司)；TS100型倒置显微镜(日本Nikon公司)；Mx3000P型PCR仪(美国Agilent公司)；Mini-PROTEAN型电泳及转膜系统，Gel Doc XR+型凝胶成像系统(美国Bio-Rad公司)。

1.2细胞培养与分组 H446细胞置于RPMI1640培养液中(含10% FBS)，于37℃、5%CO2培养箱中培养。将对数期、生长状态良好的H446细胞，接种于含RPMI1640培养液24孔板上(终浓度为5×104个细胞/ml)，每孔100 μl，于37℃、5%CO2条件下培养。24 h后，加入200 μl含不同浓度TNF-α或SP的培养液，使TNF-α终浓度为10 ng/ml(为TNF-α组)，SP终浓度分别为40、80、160、320、640 μg/ml，TNF-α终浓度为10 ng/ml+SP终浓度为320 μg/ml(为TNF-α+SP组)。对照组加入200 μl RPMI1640培养液(为Con组)。

1.3集落形成试验检测各组细胞集落形成能力 用含有10% FBS的RPMI1640培养液将Con组和TNF-α组H446细胞制成悬浮液，调整细胞密度为5×107/L，接种于内含4 ml完全培养液的24孔板中继续培养，每个处理组细胞设置5个平行孔。每孔接入100 μl悬浮液。待培养至出现肉眼可见的集落后，弃培养液；用磷酸盐缓冲液(PBS)清洗3次，加入4 ml甲醇在室温条件下固定15 min；弃甲醇，每孔加入1 ml结晶紫染液，避光染色15 min；自来水冲洗，晾干后于显微镜下计数。

1.4Transwell实验检测H446细胞迁移、侵袭能力 分别于培养24 h后检测Con组和TNF-α组细胞迁移、侵袭水平；72 h后检测经320 μg/ml SP处理细胞迁移、侵袭水平。

将不同处理组H446细胞制成悬浮液。在Transwell小室的上室中加入300 μl由RPMI1640培养液稀释的细胞悬浮液(约1×105个细胞，0.1% FBS)，下室中加入700 μl RPMI1640培养液(含20% FBS)，每个处理组细胞设6个复孔。置于37℃、5% CO2培养箱24 h，用甲醇固定后，0.1%结晶紫于室温下染色20 min，倒置显微镜下随机选取6个视野(200×)对细胞进行计数后取平均值，是为迁移细胞数。实验重复4次。

细胞侵袭实验需将40 μl稀释过的Matrigel基质胶(基质胶与无血清培养液比例为1∶5)加入Transwell小室内，37℃孵育2 h。其余步骤与迁移实验相同。实验重复4次。

1.5RT-PCR 用TRIzol reagent提取Con组和TNF-α组(处理24 h)；Con组、TNF-α组和TNF-α+SP组(处理72 h)H446细胞总RNA。按照反转录试剂盒说明书合成第一链cDNA。以此为模板参与PCR反应。以GAPDH作为内参基因，MMP-2和MMP-9 mRNA表达水平。MMP-2的上游引物序列为5′-CTCATCGCAGATGCCTGGAA-3′，下游为5′-CAGCCTAGCCAGTCGGATTTG-3′；MMP-9的上游引物序列为5′-ACGCACGACGTCTTCCAGTA-3′，下游为5′-CCACCTGGTTCAACTCACTCC-3′；GAPDH的上游引物序列为5′- GAAGGTGAAGGTCGGAGTC-3′，下游为5′-GAGATGGTGATGGGATTTC-3′。PCR反应程序为：94℃ 3 min；95℃ 30 s，60℃ 30 s，72℃ 1 min,共30个循环。PCR产物经1.0%琼脂糖凝胶系统电泳后用Bio-Rad凝胶成像仪扫描，Quantity One软件分析条带灰度值，计算MMP-2和MMP-9基因的相对表达量。

1.6Western印迹 提取Con组和TNF-α组(处理24 h)；Con组、TNF-α组和TNF-α+SP组(处理72 h)H446细胞总蛋白。定量后将蛋白样品进行SDS-PAGE凝胶电泳分离后，转膜。取PVDF膜于5%脱脂牛奶中封闭1 h。分别加入1∶1 000倍稀释的GAPDH、MMP-2和MMP-9抗体于4℃孵育24 h。洗膜后，加入1∶2 000倍稀释的二抗于室温孵育1 h。暗室内加入化学发光剂(ECL)显影后，由凝胶成像系统扫描分析。

1.7CCK-8法检测各组细胞活力 H446细胞经终浓度为40、80、160、320、640 μg/ml的SP处理72 h后，弃培养液，用PBS清洗3次，再加入100 μl无血清RPMI1640培养液和10 μl CCK-8检测液，37℃避光孵育2 h，酶标仪检测各孔450 nm处的OD值。细胞抑制率(%)=(1-处理组OD值/对照组OD值)×100%。

1.8统计学分析 采用SPSS18.0软件进行方差分析，LSD-t检验，t检验。

2 结 果

2.1TNF-α增强SCLC细胞H446的集落形成能力 如图1所示，与Con组(克隆形成数143.39±21.03)相比，TNF-α组H446细胞集落形成能力明显升高(克隆形成数286.94±31.33，P<0.05)。

2.2TNF-α促进SCLC细胞H446的迁移和侵袭 与Con组比，TNF-α组H446细胞迁移细胞数和侵袭细胞数均明显升高(P<0.05)。见表1，图2。

2.3TNF-α促进SCLC细胞中侵袭转移相关基因的表达 与Con组相比，TNF-α作用后，H446细胞中MMP-2和MMP-9 mRNA和蛋白表达水平均明显升高(P<0.05)；Western印迹分析结果与RT-PCR结果一致，见图3，表2。

图1 TNF-α作用后SCLC细胞H446集落形成情况

组别迁移细胞侵袭细胞Con组139±1698±15TNF-α组203±201)189±211)

与Con组比较：1)P<0.05,下表同

图2 TNF-α作用后SCLC细胞H446迁移和侵袭情况(×200)

图3 TNF-α作用后H446细胞中MMP-2和MMP-9蛋白表达水平

2.4SP抑制SCLC细胞H446的活力 不同浓度(40、80、160、320和640 μg/ml)的SP处理H446细胞72 h后，对H446细胞的抑制率分别是(1.23±1.00)%、(2.61±1.30)%、(7.59±1.40)%、(14.43±1.32)%和(22.74±1.31)%。H446细胞活力均受到抑制，且抑制率随处理浓度的增大而增大。

为了保证实验结果，选取抑制率≥10%的SP浓度(320 μg/ml)作为后续实验的处理浓度。

2.5SP抑制TNF-α对H446细胞增殖、迁移和侵袭的促进作用 与Con组比较，TNF-α组集落形成能力及迁移和侵袭能力均显著升高(P<0.05)，而TNF-α+SP组无明显变化。见表3，图4。

2.6SP抑制TNF-α对SCLC细胞中侵袭转移相关基因的表达量的促进作用 与Con组相比，TNF-α组MMP-2和MMP-9 mRNA和蛋白表达量均明显升高(P<0.05)，而TNF-α+SP组无明显变化。见表4，图5。

表2 TNF-α作用后SCLC细胞H466中MMP-2和MMP-9蛋白表达水平

表3 SP与TNF-α共同作用后SCLC细胞H466集落形成和迁移侵袭情况个)

图4 SP与TNF-α共同作用后SCLC细胞H446集落形成情况

表4 SP与TNF-α共同作用后H466细胞中MMP-2和MMP-9蛋白表达水平

图5 SP与TNF-α共同作用后H446细胞中MMP-2和MMP-9蛋白表达水平

3 讨 论

肺癌是一种重要的致死癌症，现已成为世界范围内日益严重的公共健康负担〔9〕。SCLC是一种恶性程度较高的肿瘤，倍增速度快，极易产生耐药性。目前，对于复发性SCLC暂无有效的治疗方法，寻找针对SCLC有效治疗靶点是近年来的研究热点〔10〕。

TNF-α参与调控细胞凋亡和炎症反应过程，在人类肿瘤中，可诱导前列腺癌细胞凋亡〔11〕。越来越多的研究发现，TNF-α可通过核因子(NF)-κB等信号通路，上调snail、twist等转录因子，下调E-钙黏蛋白，促进乳腺癌、口腔癌的侵袭、转移〔12,13〕。本研究结果提示TNF-α可促进H446细胞的增殖、迁移和侵袭。

SP是一种具有抗肿瘤、抗炎和抗氧化功能的天然活性物质，受到学者们广泛关注〔14〕。研究发现，SP以浓度依赖的方式抑制人胆管癌QBC939细胞的生长，其作用机制与抑制细胞中血管内皮生长因子(VEGF)-C和环氧合酶(COX)-2表达水平相关〔15〕。此外，SP可通过抑制转化生长因子(TGF)-β1和NF-κB信号通路抑制大鼠肝星状细胞HSC-T6细胞生长〔16〕。SP对表皮生长因子受体酪氨酸激酶(EGFR-TK)有特异的抑制活性，从而抑制肺癌细胞增殖和侵袭，并诱导细胞凋亡〔17〕。本研究发现SP对SCLC细胞H446的活力有明显的抑制作用，且这种抑制具有明显的浓度依赖性，并且抑制细胞的侵袭与迁移。

MMPs是一类含锌内肽酶的蛋白家族，是机体维持正常生理发育和功能必不可少的因子，是肿瘤治疗的重要靶点之一。MMPs是以酶原的形式产生，可被其他酶或自由基通过半胱氨酸开关机制激活。根据结构域及序列相似性的不同，MMPs可以分为四大类，其中MMP2和MMP9同属于明胶酶类，均可降解基底膜的重要的组分Ⅴ型胶原，促进肿瘤转移，在肿瘤浸润和转移中起重要作用〔18,19〕。其中，MMP9的主要生理功能包括促进VEGF的分泌和新血管的生成〔20〕。叶晓星等〔21〕研究发现，婴幼儿型血管瘤组织中MMP-9的表达水平明显高于正常婴幼儿皮肤组织，推测MMP-9表达量可作为部分肿瘤的标志物。本研究提示SP对TNF-α诱导的SCLC细胞的抑制作用与MMP-2和MMP-9有关。