杨燕 张毓

(锦州医科大学，辽宁 锦州 121000)

乳腺癌的发病率和死亡率逐年增加〔1〕。虽然目前乳腺癌的治疗有很多选择，如外科手术、激素治疗、放疗、化疗、靶向治疗〔2〕，但也存在诸多局限，如狭窄的治疗范围，增加的感染风险，对正常组织的非选择性毒性作用及严重的副作用可能在治疗完成后持续数月或数年等〔3〕。乳腺癌的特征是异常细胞的积累，可能归因于细胞增殖失衡、细胞凋亡及自噬调节紊乱〔1〕。自噬是一种进化上保守并依赖溶酶体降解缺陷细胞质和细胞器的过程，被认为是一种重要的程序性细胞死亡，由至少15个基因对其进行高度复杂的表达调控，协调完成诱导、成核、延伸和自噬溶酶体的动态过程。微管相关蛋白轻链(LC)3、Beclin1(一种哺乳动物的酵母Atg6基因同源物)及哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)在该过程中发挥了重要作用，三者处于不同的自噬阶段,mTOR作用于自噬诱导期，通过去磷酸化后激活细胞内泛素样激酶复合物诱导自噬的起始；Beclin1涉及自噬小体形成的早期阶段(成核阶段)，它与Ⅲ型磷酸肌醇3激酶(PI3KC3)形成复合体，调节其他自噬相关基因表达蛋白在自噬前体中的结构定位，从而促进自噬体形成，被认为是自噬起始的重要组成部分，LC3以LC3-Ⅰ和LC3-Ⅱ两种形式存在并参与自噬的后期，LC3-Ⅰ在正常情况下定位于细胞质，当自噬被诱导，LC3的胞质形式LC3-Ⅰ通过与脂质分子磷脂酰乙醇胺(PE)结合转化为LC3-Ⅱ，靶向定位于自噬体膜介导自噬溶酶体的形成〔1,4～6〕。自噬具有双面性，在正常细胞中，自噬可作为肿瘤抑制机制，消除有毒物质、受损的细胞器、错误折叠的蛋白质、减少氧化应激和保护细胞免受遗传损伤；在肿瘤细胞中，自噬可能在饥饿、缺氧和治疗性应激等条件下成为一种生存途径〔6,7〕。在乳腺癌的发生发展进程中，自噬被认为起着矛盾的作用，它是抑癌还是促癌取决于应激刺激的性质、遗传背景、肿瘤发生阶段等〔1〕，一些研究表明自噬减少会导致乳腺癌进展〔8～10〕，而其他研究表明自噬活性增加与乳腺癌预后较差相关〔11,12〕。本研究拟探讨乳腺癌组织中自噬相关基因LC3、Beclin1及mTOR的表达情况及其与乳腺癌发生发展及预后的相关性。

1 资料与方法

1.1一般资料 2010年1月至2013年1月在锦州医科大学附属医院行手术治疗的乳腺癌组织为乳腺癌组，同时取癌旁组织(距癌组织边缘>5 cm)为对照组。入组标准：①初诊患者，有手术指征，无手术禁忌；②术前未行放疗、化疗、生物免疫等抗肿瘤治疗；③术后病理诊断确诊为乳腺癌；④术后按乳腺癌诊疗规范根据病情完成相应治疗；⑤临床及病理资料完整，依从性好，随访内容完整可靠。排除标准：①合并其他恶性肿瘤；②确诊后需首选其他抗肿瘤治疗，而非手术治疗；③合并严重基础疾病、认知障碍或精神类疾病。共有92例符合标准的乳腺癌患者入组，年龄23～65〔平均(41.2±2.5)〕岁。按美国癌症联合委员会乳腺癌分期第6版标准〔13〕：ⅠA期11例，ⅠB期26例，ⅡA期34例，ⅡB期21例；细胞分化程度：高分化29例，中分化33例，低分化30例；有淋巴结转移者31例，无淋巴结转移者61例。患者术后随访时间为11～60个月，平均47.2个月，随访方式为入院、门诊或电话，随访期间定期复查血常规、肝肾功、心电图、肿瘤标记物、CT、骨扫描，随访截止于2018年1月，总生存期(OS)计算从术后病理确诊至患者死亡或随访结束。本研究经锦州医科大学附属医院医学伦理委员会批准，入组患者均签署知情同意书。

1.2试剂与方法 兔抗人LC3A/B单克隆抗体 (4599T、3868T) 购自Cell Signaling公司，羊抗人Beclin1(3663-100)购自艾美捷科技，兔抗人mTOR(T2949)购自Sigma公司，HRP标记的羊抗兔二抗(BHR101)购自博尔西公司。

1.3免疫组化Envision法检测LC3、Beclin1及mTOR表达 手术组织标本使用10%甲醛固定、石蜡包埋、4 μm切片，60℃温箱烘烤30 min，二甲苯脱蜡3次，每次5 min，递减梯度乙醇复水，磷酸盐缓冲液(PBS)冲洗后将切片放入柠檬酸盐缓冲液中高温修复暴露抗原，待自然冷却再次使用PBS冲洗，将切片置于3%H2O2中恒温孵育10 min封闭内源性过氧化物酶，使用蒸馏水及PBS冲洗，蛋清封闭后在室温中放置10 min，分别滴加羊抗人一抗(LC3工作浓度1∶25；Beclin1工作浓度1∶50；mTOR工作浓度1∶25)后将切片置于4℃冰箱过夜，次日使用蒸馏水及PBS冲洗后在切片上滴加辣根过氧化物酶(HRP)标记的兔抗羊二抗(工作浓度1∶100)，37℃恒温箱孵育30 min，蒸馏水及PBS液冲洗切片后使用二氨基联苯胺(DAB)试剂盒染色2～5 min，显色完成后蒸馏水冲洗切片中止显色并使用苏木素复染3～5 min，蒸馏水冲洗后1%盐酸酒精分化3～5 s，充分冲洗后递增梯度乙醇反向脱水、烤片、中性树胶封片。

1.4结果判定 免疫组化染色结果按染色强度和肿瘤细胞阳性细胞比例进行判定〔14〕，将每张染色切片的染色深浅与背景着色对比后按染色强度分级计分:无色计0分,淡黄计1分,棕黄计2分,棕褐计3分；按肿瘤细胞阳性比例计分:阴性计0分,≤10%计1分，11%～50%计2分,51%～75%计3分,>75%计4分。双盲法评分，以染色强度及肿瘤细胞阳性比例分数相乘得到的积分作为最后判定结果,≤3分为阴性，>3分为阳性。

1.5统计学方法 采用GraphPad Prism5软件绘制生存曲线图。采用SPSS17.0软件进行χ2检验、Fisher精确概率检验及Log-rank检验。

2 结 果

2.1两组LC3、Beclin1及mTOR表达情况 两组标本中均有LC3、Beclin1及mTOR表达，乳腺癌组LC3、Beclin1及mTOR表达阳性率〔41.30%(38例)、32.60%(30例)、45.65%(42例)〕显著低于对照组〔10.87%(10例)、13.04%(12例)、11.96%(11例)〕(P<0.05)。见图1。

图1 两组LC3、Beclin1及mTOR的免疫组化(DAB染色，×40)

2.2乳腺癌组LC3、Beclin1及mTOR表达与临床病理特征的关系 乳腺癌组中LC3及mTOR表达与细胞分化程度、临床分期及淋巴结转移有关(均P<0.05)，分化程度差、临床分期晚、伴有淋巴转移的患者LC3及mTOR阳性表达率明显增高。Beclin1表达与肿瘤直径、分化程度、临床分期及淋巴结转移有关(均P<0.05)。肿瘤直径≤2 cm、分化程度好、临床分期早、不伴有淋巴转移的患者Beclin1阳性表达率增高。见表1。

2.3乳腺癌组LC3、Beclin1及mTOR表达与生存期的关系 乳腺癌组LC3阳性表达组5年OS(62.63%)显著低于LC3阴性表达组(93.94%，χ2=6.391，P=0.012)；乳腺癌组Beclin1阳性表达组5年OS(94.44%)显著高于Beclin1阴性表达组(71.26%，χ2=4.352，P=0.037)；乳腺癌组mTOR阳性表达组5年OS(66.76%)显著低于mTOR阴性表达组(93.59%，χ2=4.538，P=0.033)。见图2。

表1 LC3、Beclin1及mTOR表达与乳腺癌临床病理特征的关系〔n(%)〕

图2 乳腺癌组LC3、Beclin1及mTOR表达对OS的影响

3 讨 论

自噬是一个降解细胞内成分以缓冲饥饿条件下代谢压力的过程，其失调与癌症的进展有关，基于基因表达谱的研究发现自噬相关基因与乳腺癌有关，但自噬是抑制或促进肿瘤细胞的生长一直是争论的焦点〔15〕。研究认为，自噬具有维持细胞内稳态的重要作用，在乳腺癌发生早期，自噬能够通过抑制炎症反应、控制细胞应激反应、破坏基因突变等方式阻止肿瘤的发生发展〔7,16,17〕。本研究提示乳腺癌中LC3、Beclin1及mTOR的表达与乳腺癌的发生有关。LC3是自噬体膜上的标记蛋白，存在于自噬溶酶体的降解过程中，被广泛视为自噬标志物，自噬溶酶体形成后，自噬体通过吞噬消除细胞中的有害因子并为正常细胞提供能量〔1,7〕，LC3表达水平的降低提示自噬体形成减少，细胞自噬下调；Beclin1于1999年被确认为是一种抑癌基因，在正常的乳腺上皮细胞中呈高表达，在人乳腺癌上皮组织中，Beclin1 mRNA和蛋白表达水平明显降低，而过表达Beclin1可增强自噬从而抑制人乳腺癌细胞MCF-7的细胞增殖和肿瘤形成〔18〕，40%～75%的散发性乳腺癌中存在Beclin1一个等位基因的缺失，被认为是导致乳腺癌细胞自噬缺陷及自噬活性降低的原因〔6〕；mTOR是一个丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，能够在细胞水平上将影响营养利用的生长信号进行整合从而调控细胞内能量代谢和细胞自噬等过程，mTOR对自噬有诱导作用，但营养不良的细胞外环境也会抑制mTOR的活性，因此恶性肿瘤中mTOR多为低表达，同时，乳腺癌的发生与磷脂酰肌醇-3-激酶(PI3K)/蛋白激酶B(AKT)/mTOR信号传导通路的激活关系密切，在超过30%的浸润性乳腺癌中可发现该通路中基因分子的改变〔1,7〕。三者作为作用不同自噬阶段的自噬相关基因，其表达水平的下调可能抑制正常乳腺细胞的自噬活性,从而导致乳腺癌的发生。

自噬具有双面性，在消除细胞有害因子抑制肿瘤发生的同时也可能促进肿瘤的发展，研究发现，在恶劣环境中，自噬将会通过降解细胞内蛋白质和细胞器为肿瘤细胞的生长提供能量，从而维持其在营养缺乏条件下的生存，导致肿瘤进行性发展〔7,18〕。Beclin1是抑癌基因，有研究证实Beclin1在淋巴结转移阳性、远端转移阳性及Ki67阳性的乳腺癌组织中表达更低〔5〕，同时，AKT和细胞外调节蛋白激酶(ERK)的磷酸化水平在Beclin1缺失的乳腺癌细胞MDA-MB-231中升高，Beclin1与生长因子受体信号通路持续的强度及时间存在负相关，提示Beclin1可以抑制乳腺癌细胞的侵袭转移〔19〕，这或许是本研究中发现乳腺癌患者Beclin1表达与肿瘤负荷呈负相关的原因。此外，癌症基因组图谱(TCGA)和乳腺癌国际联盟(METABRIC)两个大型数据库中乳腺癌患者的mRNA表达模式显示，与乳腺癌中恶性程度比较低的亚型(LuminalA/B)相比，Beclin1低表达在乳腺癌恶性程度比较高的亚型人类表皮生长因子(HER)-2和基底细胞样(多为三阴性)中更常见，并且与晚期肿瘤级别密切相关〔9〕。肿瘤直径、细胞分化程度、临床分期及淋巴结转移情况均是体现肿瘤负荷和恶性程度的临床病理指标，对乳腺癌患者的预后具有一定的预测作用，而本研究的生存分析结果也证实了这一点。由于自噬在乳腺癌中的矛盾性，LC3、Beclin1及mTOR对乳腺癌预后的预测作用尚不明确，TCGA和METABRIC两个大型数据库中乳腺癌患者的mRNA表达模式显示LC3和mTOR高表达量的患者生存率显著低于低表达量者，与本研究结果一致〔9〕。有研究从几个独立队列的mRNA和蛋白水平上验证得出LC3是三阴性乳腺癌不良预后的可靠标记的结论，抑制自噬是三阴性乳腺癌一种有前途的治疗策略，而LC3对乳腺癌其他亚型的预后无预测价值〔20〕；而针对23项不同癌症的研究进行系统审查和荟萃分析则显示Beclin1可能是胃癌、乳腺癌和淋巴瘤有利预后的预测因素，LC3可能预示乳腺癌的不良预后(HR=1.98,95%CI=1.25～3.13)〔21〕，Tang等〔9〕也发现Beclin1的低表达与预后不良有关，其表达是生存的独立预测因子。当前大部分研究还是倾向于Beclin1的表达下降与预后不良和整体生存率降低有关，在乳腺癌中，Beclin1表达越高其预后越好〔22〕。

综上，LC3、Beclin1及mTOR在乳腺癌中表达均降低，与乳腺癌的发生发展及预后相关。自噬的失活与乳腺癌患者的生存期缩短有关，自噬信号的预后价值独立于已知的临床预后因素，包括年龄、肿瘤大小、级别、雌激素受体状态、孕激素受体状态、酪氨酸激酶受体(ERBB)2状态、淋巴结状态和肿瘤蛋白53突变状态，同时，自噬信号也可以预测乳腺癌无远处转移的存活率〔15〕，但由于自噬过程调控的复杂性，尚需针对不同的乳腺癌亚型进行大样本的前瞻性研究并深入探讨基因层面的机制调控，以寻找到针对乳腺癌的特异性自噬信号开发新的治疗策略。