晏子友，万鸣宏，杨 林，杨芸琪，黄 伟，沈金峰，罗富里，皮持衡

慢性缺氧是慢性肾脏病病理改变的主要原因之一，在慢性缺氧过程中肾小管上皮细胞(renal tubular epithelial cell，RTEC)凋亡会诱发肾小管坏死，加速慢性肾脏病进展[1-2]。自噬最初描绘成吞噬自身细胞质蛋白或细胞器并使其包被与溶酶体融合形成自噬溶酶体，降解内容物以获取能量的过程，可能与多种疾病的发生有关[3-5]。在肾脏病早期机体远端组织和器官可出现生物学行为改变，在肾脏病患者中肺、心脏均可出现自噬，但机制尚不明确[6]。目前已证实在慢性肾脏病早期即可出现微小核糖核酸(microRNA，miRNA)的差异性表达，miRNA与细胞自噬等多种生物学行为密切相关[7]。外泌体是细胞和脏器传递生物学信息的重要媒介，外泌体中含有的miRNA是外泌体干预细胞功能的主要机制，也可能是肾脏细胞沟通远端脏器的枢纽，可能是肾脏病患者远端脏器组织自噬的主要原因[8]。该研究采用体外缺氧模型培养RTEC，探讨缺氧状态下RTEC外泌体中自噬相关miRNA分泌情况。

1 材料与方法

1.1 主要材料与试剂大鼠RTEC株(NRK-52E) 购自中国典型培养物保藏中心(武汉CCTC公司)；胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)和 DMEM培养基购自上海赛默飞世尔科技有限公司；miRNA反转录试剂盒/PCR试剂盒、cel-miR 39购自北京天根生化科技有限公司、BCA蛋白浓度试剂盒购自北京碧云天生态园林科技有限公司；ExoQuick-TC 外泌体提取试剂盒购自美国SBI公司。

1.2 miRNA的生物信息学预测利用mi-croRNA.org、Target Scan、miRanda及PicTar等生物信息学软件查阅文献确定将 miRNA-30b、miRNA-30c、miRNA-214、miRNA-183、miRNA-200a作为自噬相关miRNA研究对象。

1.3 RTEC干预和外泌体提取缺氧干预与分离外泌体：采用无外泌体的10%FBS培养基分皿接种培养NRK-52E细胞，待细胞融合达60%后换用无血清培养基培养12 h同步化，后换含无外泌体1% FBS培养基并分别放入常氧(37 ℃、21%O2、5% CO2)、缺氧(37 ℃、1%O2、5%CO2)培养箱培48 h，收集两2组细胞培养上清，加入2 ml的 ExoQuick -TC沉淀液，反复颠倒3次使其混匀；冷藏(4 ℃)过夜(12 h)； 10 000 r/min离心ExoQuick-TC 混合液 30 min。离心后外泌体沉淀位于试管底部，呈浅褐色或白色。

1.4 外泌体和细胞蛋白浓度取2组重悬液，据BCA试剂盒说明书操作，最后在562 nm波长处测量各样品孔吸光度值，根据标准曲线计算外泌体蛋白浓度；同时测定常氧及缺氧RTEC的蛋白浓度，计算外泌体蛋白浓度与细胞蛋白浓度比值。

1.5 RT-PCR检测肾脏细胞外泌体中miRNA表达量取等蛋白量的常氧及缺氧外泌体各加入5 pmol的cel-miR 39作为外参，根据北京天根试剂盒说明书提取外泌体总RNA，反转录并使用实时荧光定量PCR测定miRNA-30b、miRNA-30c、miRNA-214、 miRNA-183、miRNA-200a的表达量，以上miRNA引物由北京天根公司设计合成。

1.6 外泌体的鉴定采用细胞裂解液处理细胞后离心去上清液为总蛋白，变性后每孔加入30 μg总蛋白行10%SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳，湿转移至PVDF膜，5%牛血清白蛋白BSA室封闭60 min，孵育一抗过夜，加入二抗室温孵育60 min，扫描成像。

1.7 统计学处理采用SPSS 16.0进行统计分析。两样本比较，使用独立样本t检验；方差齐的多样本均数的比较使用单因素方差分析，多重比较使用LSD法；方差不齐的多样本均数的比较使用Welch法，多重比较使用 Dunnetts T3法。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 缺氧对外泌体基本特征的影响以细胞蛋白为阳性参照，2组重悬后Western blot结果均提示表达外泌体标志性蛋白CD63，见图1；取离心后沉淀重悬后电镜下观察，镜下常氧和缺氧组囊泡均可见圆形或椭圆形的环状结构，有完整的薄膜，直径在60～150 nm，多个视野对比，均未见明显异常，见图2。

图1 Western blot 检测细胞外泌体标志物CD63的表达

图2 2组大鼠外泌体形态的比较A：常氧组；B：缺氧组

2.2 缺氧对外泌体分泌量的影响随着时间进展，12、24、48 h常氧组和缺氧组外泌体总蛋白均增加，差异有统计意义，但2组细胞对应时间点分泌的外泌体总蛋白差异无统计学意义；12、24、48 h外泌体总蛋白用对应的细胞蛋白标化，结果显示12、24 h时缺氧组外泌体/细胞蛋白比值较常氧组无明显变化，48 h时缺氧组外泌体/细胞蛋白比值相较常氧组高，且差异有统计学意义，见表1。

表1 缺氧对外泌体分泌量的影响

与对应时间点缺氧组比较：*P<0.05

表2 缺氧对外泌体中自噬相关miRNA表达谱的影响

与对应时间点缺氧组比较：*P<0.05

2.3 缺氧对外泌体中自噬相关miRNA表达量的影响缺氧组患者血清中miRNA-30b、miRNA-30c、miRNA-214、miRNA-183、miRNA-200a水平明显增高，而且高于常氧组，差异有统计学意义，而常氧组miRNA-30b、miRNA-30c、miRNA-214、miRNA-183、miRNA-200a含量无明显变化，见表2。

3 讨论

缺氧是急慢性肾脏病患者的主要病理生理机制之一。越来越多的研究[9-11]证实急性肾损伤(acute kidney injury，AKI)甚少单独发生，并且肾损伤与远端脏器(肺、肝、心、脑、消化道、骨髓)等之间存在复杂的交互作用。本研究在缺氧环境下培养肾小管上皮模拟AKI过程中肾脏细胞缺血缺氧的过程，通过标准化检测后发现缺氧环境下肾脏细胞分泌外泌体的量明显增多，并且随着缺氧时间的延长，外泌体的含量逐渐上升。这可能是细胞对外环境改变释放的一种信号。

自噬是广泛存在于真核细胞中的生命现象，是生物在发育、衰老的过程中存在的一个消除自身多余或者受损细胞器以及维持细胞稳态的共同机制[12]。 在急慢性肾脏病疾病模型中心脏、肺、肌肉多数远端脏器和组织均存在自噬的现象[13]。目前肾脏病患者远端脏器功能改变的具体机制尚不完全明确，可能与细胞炎症因子浸润、尿毒症毒素侵袭有关，此外遗传信息的传递可能在远端脏器行为改变中存在重要的临床意义[14-15]。外泌体是细胞分泌的囊泡，携带多种生物学信息，是沟通远端细胞的主要媒介，可能参与急慢性肾损伤中远端脏器功能损伤。当AKI发生时肾脏细胞分泌大量miRNA，这些miRNA由外泌体包裹并被释放入血，可能对远端脏器、细胞生物学行为造成影响。本研究建立体外培养肾小管上皮细胞模型，定量检测自噬相关miRNA表达量的影响，结果证实随着缺氧时间的延长外泌体中miRNA-30b、miRNA-30c、miRNA-214、miRNA-183、miRNA-200a发现了显著变化，这意味着细胞外环境改变可能导致细胞外泌体中miRNA表达谱改变，进而可能影响细胞的生物学行为，通过进一步分析不同缺氧时间段患者miRNA表达谱的关系，结果提示随着缺氧时间的延长，miRNA表达量明显上升。提示外泌体中miRNA表达与肾脏病变的程度密切相关，而此类miRNA在外泌体的包裹下可能导致影响远端脏器的行为，干预机体重要脏器的生物学行为，这可能是肾脏病早期远端脏器发生适应性变化的重要原因。

本研究关注的是外泌体中miRNA表达谱在缺氧时量的上升与肾脏疾病重要脏器的自噬行为有一定程度关联，但是否还有血液中其他因素的影响，还有待于进一步研究。

综上所述，缺氧可以影响肾脏细胞外泌体的分泌，影响外泌体的量和外泌体中包裹的miRNA的表达，缺氧环境下证实外泌体中自噬相关miRNA表达均明显上调，缺氧环境下RTEC外泌体中自噬相关miRNA表达上调可能参与重要脏器的生物学行为，这为进一步研究慢性肾脏病患者重要脏器自噬行为奠定了坚实的基础。