符婕 王红 孙红梅

(1佳木斯市中心医院妇产科，黑龙江 佳木斯 154002;2佳木斯市肿瘤医院肿瘤内科)

宫颈癌(UCC)是临床上最常见的恶性肿瘤之一，位居女性所有恶性肿瘤的第四位。在全部恶性肿瘤中UCC也高居前列，是全球第七大恶性肿瘤〔1〕。其发病率存在显著的地区差异，有超过85%的UCC患者来自于发展中国家，占女性恶性肿瘤的13%。此外，UCC相关死亡率为52%，也多见于发展中国家〔2〕。UCC的危险因素包括慢性炎症、吸烟、应用口服避孕药、维生素A和E 摄入不足等〔3〕。趋化因子是一类小分子蛋白质，它们可以调控多种组织的功能，包括内环境的稳态和在炎症条件下细胞的招募和激活。CXC趋化因子配体(L)8是CXC趋化因子中谷氨酸-亮氨酸-精氨酸(ELR)+亚家族中的一员，它可经其受体CXCR1和CXCR2调控细胞的多种功能。大量研究表明，在适当的刺激下，CXCL8可以被多种细胞所分泌，如单核细胞、内皮细胞、T淋巴细胞、成纤维细胞、肿瘤细胞、上皮细胞、肝细胞、巨噬细胞、滑膜细胞及角质形成细胞等〔4〕。近年来诸多研究表明，CXCL8在多种肿瘤中发生表达上调，并且其可通过多种信号途径，如磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)/蛋白激酶B(AKT)、丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)、核因子(NF)-κB而参与并影响肿瘤的增殖、侵袭、转移和血管形成等〔5〕。本实验研究外源性及过表CXCL8是否可经内分泌和自分泌机制影响HeLa细胞增殖和迁移的恶性行为，同时探寻CXCL8发挥作用的信号通路。

1 材料与方法

1.1主要细胞、试剂和材料 HeLa宫颈癌细胞(美国典藏细胞库)；RPMI1640 培养基(美国Hyclone公司)；胎牛血清(FBS，美国GIBCO公司)；CXCL8酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒(武汉博士德公司)；细胞增殖检测试剂(CCK)-8试剂盒(碧云天生物)；细胞培养板、培养瓶及细胞迁移(Transwell)小室(美国Hyclone公司)；AKT抗体(美国Santa Cruz公司)。

1.2细胞转染 将HeLa细胞按5×105个/孔培养在6孔板中，孔板中的培养基为3 ml含15% FBS、无青链霉素的RPMI1640 培养基；细胞在95%饱和湿度37℃培养箱中培养36 h；移除培养基，按照Lipofectamine 2000试剂操作手册对细胞实施转染；细胞转染后在37℃培养箱中培养36 h，然后用4 ng/μl的遗传霉素(G418)进行稳定转染细胞株的筛选；应用ELISA来鉴定转染效率。

1.3ELISA 将细胞按6×105个/孔培养于6孔板中，培养基为1 ml含2 % FBS的RPMI1640；待细胞培养24 h后，收集细胞培养上清液并在室温下离心以去除细胞碎片；按照CXCL8 ELISA试剂盒操作检测上清液中CXCL8含量。

1.4细胞增殖实验 为了明确外源性CXCL8是否调控了HeLa细胞增殖，将HeLa细胞按2.0×103细胞/孔接种到96孔板中，细胞所用培养基为100 μl含不同浓度重组CXCL8(0、20、40或60 ng/ml)的RPMI1640；在CXCL8自分泌研究中，将亲代、空载体转染和CXCL8转染的Hela细胞(1.5×103细胞/孔)培养在96孔板中。将上述实验细胞在95%饱和湿度的37℃培养箱中分别培养24、48和72 h；按照CCK-8操作后，在酶标仪下读得450 nm处的光密度值，以确定细胞增殖情况。

1.5细胞迁移实验 利用Transwell小室进行细胞迁移实验，进行下列步骤研究外源性及过表达CXCL8对HeLa细胞迁移能力的影响。①外源性研究：将2×104个HeLa细胞重悬于100 μl无FBS的RPMI1640培养基中，并培养于Transwell上室中，将600 μl含10 %FBS和不同浓度重组CXCL8(0、20、40或60 ng/ml)的RPMI1640培养基置于Transwell下室中；②过表达研究：将2×104个亲代、空载体转染和CXCL8转染的HeLa细胞分别重悬于100 μl无FBS的RPMI1640培养基中，并培养于Transwell上室中，将600 μl含10%FBS的RPMI1640培养基置于Transwell下室中。将上述实验细胞在95%饱和湿度的37℃培养箱中分别培养24 h和36 h；然后用棉签刮去小室上表面的非迁移细胞；磷酸盐缓冲液(PBS)清洗后，在室温下用含0.5%结晶紫溶液的95%乙醇固定染色20 min；PBS清洗后，在显微镜下随机观察和计数5个视野的迁移细胞。

1.6统计分析 应用SPSS22.0统计学软件进行t检验。

2 结 果

2.1过表达细胞株的筛选 亲代、空载体转染和过表达CXCL8的HeLa细胞培养上清液中CXCL8分泌性蛋白的表达量分别为(205.44±12.91)、(199.86±17.18)和(403.16±17.03)ng/ml。HeLa细胞可表达CXCL8分泌性蛋白。与亲代和空载体转染细胞株比较，过表达细胞株的CXCL8分泌性蛋白水平显著升高(P<0.01)，提示成功构建了CXCL8稳定转染细胞株。

2.2外源性CXCL8促进HeLa细胞的增殖 与0 ng/ml CXCL8比较，不同浓度外源性CXCL8可显著促进HeLa细胞增殖活性(P<0.05)。见表1。

2.3过表达CXCL8促进HeLa细胞的增殖 培养48 h和72 h后，过表达细胞的增殖率显著高于亲代和空载体转染细胞株(P<0.05)。见表2。

表1 培养不同时间外源性CXCL8促进HeLa细胞增殖光密度)

与0 ng/ml比较：1)P<0.05；2)P<0.01；表3同

表2 培养不同时间过表达CXCL8促进HeLa细胞增殖光密度)

与亲代、空载体转染细胞比较：1)P<0.05；2)P<0.01

2.4外源性CXCL8促进HeLa细胞的迁移 不同浓度的外源性CXCL8可显著促进HeLa细胞的迁移活性(P<0.05)。见表3。

表3 诱导迁移不同时间外源性CXCL8促进HeLa细胞迁移个)

2.5过表达CXCL8促进HeLa细胞的迁移 过表达细胞的迁移细胞数显著高于亲代和空载体转染细胞株(P<0.01)。见表4。

表4 诱导迁移不同时间过表达CXCL8促进HeLa细胞迁移个)

与亲代、空载体转染细胞比较：1)P<0.01

2.6过表达CXCL8上调AKT蛋白的表达 亲代、空载体转染及CXCL8过表达细胞AKT蛋白相对表达量分别是0.468±0.10、0.493±0.08和0.980±0.13。与亲代和空载体转染细胞株比较，CXCL8过表达细胞的AKT蛋白相对表达量显著增高(P<0.01)。

3 讨 论

作为促炎性ELR+CXC类趋化因子，CXCL8最初被命名为中性粒细胞趋化因子，这是由于其可通过影响嗜中性粒细胞的趋化与激活，在天然免疫的诱导中发挥重要的调节作用〔6〕。因此，CXCL8与许多炎症性疾病如炎症性肠病和类风湿关节炎等密切相关〔5〕。尽管炎症是机体对组织损伤的一种生理性保护过程，但近年的研究显示，它在肿瘤的发生、发展及演进中也扮演重要角色。据统计，许多慢性炎症状态会显著增加患某种癌症的风险，近20%的癌症是由慢性炎症或炎症状态引发的〔7〕。局部组织的慢性炎症可使细胞基因组出现不稳定而发生恶变，并进而促进肿瘤细胞的生长、转移和血管生成。在女性生殖系统中，人类乳头瘤状病毒(HPV)感染被认为是宫颈癌进展的主要危险事件，提示炎症在UCC发生发展中亦发挥重要的作用。

近年来，大量研究表明，CXCL8在多种肿瘤组织中被检测到表达上调。例如，在前列腺癌中，肿瘤患者血清 CXCL8水平较健康志愿者显著提高，并且其表达水平与肿瘤的转移和分期具有显著相关性〔8〕。又如，CXCL8在膀胱癌中也出现表达上调，它的过度表达与疾病晚期有关，且高表达CXCL8可显著降低膀胱癌患者的总体生存率〔9〕。另外，大量研究亦揭示了CXCL8参与多种肿瘤的发生及演进过程。如在前列腺癌中，雄激素依赖是肿瘤发展的主要驱动力，Seaton等〔10〕应用体外模型实验研究了CXCL8信号在驱动雄激素非依赖性转变中的作用。他们发现，CXCL8可通过雄激素非依赖方式诱导雄激素受体的表达和活化，并促进雄激素依赖前列腺癌细胞 LNCaP和22RV1的增殖。目前人们普遍认为，招募到肿瘤部位的中性粒细胞对肿瘤进程至关重要，特别是肿瘤血管的生成。既然CXCL8的主要生理功能是趋化和激活中性粒细胞，表明CXCL8可参与中性粒细胞介导的肿瘤促进作用。已有研究表明，通过抑制 CXCL8或其受体 CXCR1/2可延缓中性粒细胞向肿瘤部位的招募和趋化，并最终抑制肿瘤在体内生长〔11〕。本研究发现外源性和过表达CXCL8可显著促进HeLa UCC细胞的增殖和迁移能力，同时机制研究显示，HeLa细胞过表达CXCL8可显著上调AKT蛋白的表达。这说明CXCL8可经PI3K/AKT信号途径参与UCC的恶性转化进程，该研究将补充人们对UCC发生机制的认识，并可为其临床诊治提供一定的借鉴思路。