朱翔，陈功,2，万鹏，刘瑞，李恒,2*

(1.四川东坡中国泡菜产业技术研究院，四川 眉山 620036；2.四川省食品发酵工业研究设计院，成都 611130；3.四川省川南酿造有限公司，四川 眉山 620030)

泡辣椒是四川泡菜的典型代表之一，以湿态发酵方式加工而成，具有色泽红亮、鲜嫩清脆、酸辣风味和营养丰富等特点[1,2]。泡辣椒是由新鲜蔬菜经发酵后成熟，含有多种微生物[3]，使泡辣椒产品在贮运、销售过程中易发生胀袋、胀罐、溢汁等不良现象[4]，严重阻碍企业的发展。目前，在对酱腌菜中腐败微生物的控制研究中，王向阳等[5]通过纳他霉素、富马酸和亚硫酸氢钠来控制发酵成熟的萝卜干的贮藏问题；姜绍通等[6]研究脱氢醋酸钠、Nisin和尼泊金复合酯钠3种防腐剂控制腌制蔬菜中的腐败细菌；Bari M L等[7]研究植酸和Nisin控制蔬菜品种的中李斯特菌的生长，但是针对泡辣椒中产气微生物的控制研究报道较少。本实验通过对山梨酸钾、脱氢乙酸钠、苯甲酸钠和乙二胺四乙酸二钠4种抑菌剂进行研究，采用单因素实验结合响应面法，得到最佳的复合抑菌剂，应用于泡辣椒产品中，以延长产品的货架期，减少食品防腐剂的添加，提升企业的市场竞争力。

1 材料与方法

1.1 原料与试剂

实验菌种：从胀袋泡辣椒样品中筛选出3株产气微生物，其中2株真菌L1(Kazachstaniaexigua)、L2(Saccharomycescerevisiae)，1株细菌L3(Pseudomonasfluorescens)；山梨酸钾、脱氢乙酸钠：南通醋酸化工股份有限公司；乙二胺四乙酸二钠：常州德烨化工有限公司；苯甲酸钠：天津东大化工集团有限公司；葡萄糖(一水)：成都市科龙化工试剂厂；酵母浸粉、麦芽浸粉、蛋白胨：北京奥博星生物技术有限责任公司。

1.2 仪器与设备

ME204/02电子天平 梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司；L6S紫外可见分光光度计 上海仪电分析仪器有限公司；TH2-C-1摇床振荡培养箱 苏州培英实验设备有限公司；DHP-9270B智能电热培养箱 成都瑞昌仪器制造有限公司；MJ-54A高压灭菌锅 施都凯仪器设备(上海)有限公司。

1.3 实验方法

1.3.1 培养基的配制

1.3.1.1 YM液体培养基

酵母浸粉3 g/L，麦芽浸粉3 g/L，葡萄糖(一水)10 g/L，蛋白胨5 g/L，pH 6.0～6.4；121 ℃高压灭菌20 min。

1.3.1.2 PCA液体培养基

胰蛋白胨 5.0 g/L，酵母浸粉 2.5 g/L，葡萄糖(一水)1.0 g/L，pH 7.0±0.1；121 ℃高压灭菌20 min。

1.3.1.3 泡辣椒液体培养基

泡辣椒水50 mL，泡菜汁50 mL，以泡菜汁和泡辣椒水的质量计，添加1.0%蛋白胨，121 ℃高压灭菌20 min。其中泡菜汁为取发酵成熟泡辣椒，打碎，以泡辣椒∶蒸馏水为1∶2的比例添加，加热煮沸10 min，过滤，得泡菜汁。

1.3.2 菌悬液的制备

将0.2 mL L1和L2菌种分别接入10 mL YM液体培养基中，30 ℃下摇床培养16～18 h，菌悬液保存于冰箱备用；将0.2 mL L3菌种接入10 mL PCA液体培养基中，37 ℃下摇床培养12～14 h后，菌悬液保存于冰箱备用。

1.3.3 评价抑菌效果的方法

1.3.3.1 绘制标准曲线

取9 mL泡菜汁培养基，接种1 mL各菌株的菌悬液，其中 L1和L2菌种在30 ℃下摇床培养14 h，L3菌种在37 ℃下摇床培养12 h，做空白对照。菌株培养完成后，得到培养后的菌悬液，用无菌生理盐水进行稀释，配制菌悬液含量分别为5%、10%、20%、40%、60%、80%，以空白组的培养基作为对照，测定稀释后的不同浓度的菌悬液在600 nm处的OD值，绘制成标准曲线[8]。

1.3.3.2 计算抑菌率的方法

将各培养后的菌悬液接种到泡菜汁培养基中，菌株初始菌量为胀袋泡辣椒样品的初始菌量左右，其中L1和L2的接种量为5.50×106CFU/mL，L3的接种量为6.70×107CFU/mL。在泡辣椒液体培养基中添加不同浓度的防腐剂，其中L1和L2菌种在30 ℃下摇床培养14 h，L3菌种在37 ℃下摇床培养12 h，在600 nm下测定其OD 值。将接种相同的菌株，以不添加防腐剂的培养基作为对照组，在相同条件下培养，然后在600 nm下测定吸光值[9]，每次实验重复3次。

1.3.4 单一防腐剂对泡菜中产气微生物抑制效果研究

根据 GB 2760—2014的规定和相关文献记载[10]，选用山梨酸钾、脱氢乙酸钠、苯甲酸钠和乙二胺四乙酸二钠4种防腐剂作为抑菌剂，对L1、L2和L3 3株产气微生物进行抑菌实验，用抑菌率来表示防腐剂的抑菌效果，单一防腐剂的浓度水平见表1。

表1 防腐剂浓度水平Table 1 Concentration levels of preservatives g/L

1.3.5 响应面试验设计复合防腐剂对泡菜中产气微生物抑制作用研究

根据单因素试验结果，选择3种抑菌效果较好的防腐剂为试验因子，以产气微生物的抑菌率为响应值，采取响应面设计，优化出最佳的对产气微生物的抑菌效果，抑菌率≥99.0%[11]。试验结果采用Design-Expert V8.0.5b软件中的Box-Behnken 法则进行响应面试验设计[12-14]。

1.3.6 复合防腐剂对泡辣椒产气的验证

取发酵成熟的泡辣椒产品，按500 g/袋分装，121 ℃杀菌15 min。将菌悬液接种到杀菌后的辣椒样品中，菌株初始菌为1.3.3.2方法中的量，再添加实验所得的最佳复配防腐剂方案，30 ℃恒温放置，观察是否有胀袋现象，实验有3个平行样。

2 结果与分析

2.1 试验菌的标准曲线

2.1.1 活化后产气微生物活菌数测定

分别取1.3.3.1培养后的菌悬液1 mL，测定其活菌数，结果见表2。

表2 3株产气微生物活化后菌落总数Table 2 Total number of colonies activated by three aerogens

2.1.2 产气微生物的线性回归方程

以3株产气微生物在600 nm的吸光度测定值为纵坐标，以菌悬液的稀释浓度为横坐标，得出标准曲线，结果见图1。

图1 3株产气微生物标准曲线Fig.1 The standard curves of three aerogens

通过对3株产气微生物的标准曲线进行线性拟合，得出回归方程，见表3。其中3株产气微生物线性回归方法的R2均大于0.99，说明拟合性较好。

表3 3株产气微生物标准曲线的线性回归方程Table 3 The linear regression equations of the standard curves of three aerogens

2.2 单一防腐剂对产气微生物抑菌率结果

2.2.1 不同浓度山梨酸钾对产气微生物抑制效果的影响

图2 不同浓度山梨酸钾对产气微生物的抑制效果Fig.2 Effect of different concentration of potassium sorbate on the inhibition of aerogens

由图2可知，山梨酸钾对3株菌均有明显的抑制效果，随着山梨酸钾浓度的逐渐增大，抑菌率逐渐增大。其中山梨酸钾的浓度为0.2 g/L时，对L1的抑制率为43.99%，对L2的抑制率为35.80%，对L3的抑制率为58.54%；当山梨酸钾的浓度达到0.5 g/L时，对L1、L2和L3的抑菌率均大于70%，分别为80.13%、74.54%和83.52%；当山梨酸钾的浓度达到最大1.1 g/L时，抑制率最大，但均小于99.0%，不能控制产气微生物。因此可以得出，山梨酸钾对这3株菌都有着相对较强的抑制作用，综合考虑，确定山梨酸钾的添加量为 0.20～0.40 g/L。

2.2.2 不同浓度脱氢乙酸钠对产气微生物抑制效果的影响

图3 不同浓度脱氢乙酸钠对产气微生物的抑制效果Fig.3 Effect of different concentration of sodium dehydroacetate on the inhibition of aerogens

由图3可知，脱氢乙酸钠对3株菌均有明显的抑制效果，随着脱氢乙酸钠浓度的不断增加，抑菌率也越来越大。其中当脱氢乙酸钠浓度为0.30 g/L 时，对L1、L2、L3 3株菌的抑制率都达到 80% 以上，抑制率分别为88.87%、86.43%、82.27%。当脱氢乙酸钠浓度为0.50 g/L时，除 L3外，其余2株菌的抑制率达到了90%以上，可见，脱氢乙酸钠对L3的抑制效果相对较低，脱氢乙酸钠浓度达到最大1.1 g/L时，抑制率最大，但均小于99.0%，不能控制产气微生物。因此可以得出，脱氢乙酸钠对这3株菌都有着较强的抑制作用，综合考虑，确定脱氢乙酸钠的添加量为 0.10～0.30 g/L。

2.2.3 不同浓度苯甲酸钠对产气微生物抑制效果的影响

图4 不同浓度苯甲酸钠对产气微生物的抑制效果Fig.4 Effect of different concentration of sodium benzoate on the inhibition of aerogens

由图4可知，随着苯甲酸钠浓度的逐渐增加，对3株菌的抑制效果也越来越明显。其中当苯甲酸钠浓度为0.30 g/L 时，对L1、L2、L3 3株产气微生物的抑制率都达到70%以上，抑制率分别为71.11%、78.88%、90.31%，其中相同浓度的苯甲酸钠对L3的抑菌率明显比L1和L2的抑菌率高，当苯甲酸钠浓度达到最大1.1 g/L时，抑制率最大，但均小于99.0%，不能控制产气微生物。因此可以得出，苯甲酸钠对这3株菌都有着较强的抑制作用，综合考虑，确定苯甲酸钠的添加量为 0.10～0.30 g/L。

2.2.4 不同浓度乙二胺四乙酸二钠对产气微生物抑制效果的影响

图5 不同浓度乙二胺四乙酸二钠对产气微生物的抑制效果Fig.5 Effect of different concentration of EDTA on the inhibition of aerogens

由图5可知，随着乙二胺四乙酸二钠浓度的逐渐增加，对3株菌的抑制效果也在逐渐增强。但当乙二胺四乙酸二钠浓度为0.25 g/L 时，对L1、L2、L3 3株产气微生物的抑制率都未达到50%，由此可以看出在国家相关标准规定的添加量下，乙二胺四乙酸二钠不能有效地抑制3株菌的生长繁殖。综合考虑，乙二胺四乙酸二钠不作为复合防腐剂中的一种。

2.2.5 防腐剂对产气微生物抑菌率的响应面试验结果分析

2.2.5.1 回归模型的建立及方差分析

在单因素试验结果的基础上，设计响应面法[15]。因素和水平见表4，试验结果见表5。

表4 Box-Behnken试验设计Table 4 Design of Box-Behnken experiment g/L

表5 Box-Behnken试验设计及结果Table 5 Design and results of Box-Behnken experiment

续 表

使用软件Design-Expert 8.0.6.1，以不同浓度的山梨酸钾、脱氢乙酸钠以及苯甲酸钠为响应变量，同时以抑菌率为指标值(响应值)，通过二次多项式拟合(非线性)，得到L1抑菌率(Y1)、L2抑菌率(Y2)以及L3抑菌率(Y3) 为目标函数的二次回归方程：

Y1=99.43+3.61A+2.71B+2.55C+0.68AB+1.91AC-4.02BC-3.13A2-7.12B2-4.08C2，

Y2=99.50-1.09A+13.26B+5.67C-2.23AB-1.71AC-0.078BC-6.37A2-11.06B2-8.30C2，

Y3=99.47-1.07A-0.89B+0.71C-0.55AB-0.34AC+0.85BC-5.31A2-0.84B2-1.44C2。

表6 响应面试验回归模型方差分析Table 6 Analysis of variance of response surface regression model

续 表

注：“*”表示显著(0.01

由表6可知，回归模型的P值均小于 0.0001，达到了极显著水平，说明该模型显著回归，能够很好地反映L1、L2、L3 3株产气微生物的抑制率与不同防腐剂之间的相互关系。该模型的失拟项P值分别为0.0576，0.7592和0.3839，均大于0.05，差异不显著，说明该回归模型与实际试验具有较好拟合性，自变量与抑菌率之间关系显著，相关系数 R2分别为0.9858，0.9987，0.9918，RAdj2分别为0.9676，0.9970，0.9812，表明响应面法设计所得的回归模型有效，适用于此复合防腐剂对泡辣椒中产气微生物的抑制研究提供理论预测。

2.2.5.2 响应面分析

图6 各因素交互作用对L1抑菌率的响应面Fig.6 Response surface of interaction of various factors on the inhibition rate of L1

由图6和表6可知，当山梨酸钾、脱氢乙酸钠和苯甲酸钠交互作用时，对L1均显著，对L1的抑菌率随着山梨酸钾、脱氢乙酸钠和苯甲酸钠添加量的增大均呈先上升后下降的趋势；由图7和表6可知，当苯甲酸钠取零点值时，山梨酸钾和脱氢乙酸钠的等高线趋于圆形，交互作用不显著；由图8和表6可知，当山梨酸钾取零点值时，脱氢乙酸钠和苯甲酸钠的等高线趋于圆形，交互作用不显著。

图7 各因素交互作用对L2抑菌率的响应面Fig.7 Response surface of interaction of various factors on the inhibition rate of L2

图8 各因素交互作用对L3抑菌率的响应面Fig.8 Response surface of interaction of various factors on the inhibition rate of L3

利用Design-Expert软件，通过对两个二次回归方程进行联合求解，得出当山梨酸钾添加量为0.29 g/L、脱氢乙酸钠添加量为0.26 g/L和苯甲酸钠添加量为0.31 g/L时，对L1的抑菌率达到最大，理论预测值为99.75%；当山梨酸钾添加量为0.32 g/L、脱氢乙酸钠添加量为0.22 g/L和苯甲酸钠添加量为0.30 g/L时，对L2的抑菌率达到最大，理论预测值为100.326%，当山梨酸钾添加量为0.24 g/L、脱氢乙酸钠添加量为0.28 g/L和苯甲酸钠添加量为0.30 g/L时，对L3的抑菌率达到最大，理论预测值为102.697%，对最佳复配防腐剂进行验证研究，结合实际生产需要，综合考虑复配防腐剂对泡辣椒中产气微生物的抑制研究，将预测条件校正为山梨酸钾0.30 g/L，脱氢乙酸钠0.25 g/L，苯甲酸钠0.30 g/L。该结果符合GB 2760-2014《食品添加剂使用标准》，在此研究优化工艺条件下，对实验中的L1、L2、L3 3株产气微生物的抑制率达到99.50%以上，与模型理论预测的偏差为0.25%左右，由此可以得出该响应面的回归模型具有可行性。

2.2.6 复合防腐剂对泡辣椒产气验证结果

根据响应面结果分析，3种防腐剂对L1、L2、L3 3株产气微生物的显著性不同。将按照山梨酸钾0.30 g/L，脱氢乙酸钠0.25 g/L，苯甲酸钠0.30 g/L组合添加到袋装泡辣椒产品中，30 ℃下放置5 d后，观察到添加复合防腐剂的泡辣椒产品无胀袋现象，空白组产品出现严重胀袋现象。由此得出，添加复合防腐剂对比空白组，有较好的抑菌作用，该复合防腐剂对产品有很好的保质和贮存效果。

3 结论

通过研究得出，乙二胺四乙酸二钠作为抑菌剂对产气微生物的控制效果较差，山梨酸钾、脱氢乙酸钠和苯甲酸钠有较为明显的抑菌效果，但都不能完全控制住产气微生物的生长，故通过复配防腐剂，结合单因素结果，采用响应面分析方法，考虑实际生产需要，将山梨酸钾添加量为0.30 g/L，脱氢乙酸钠添加量为0.25 g/L，苯甲酸钠添加量为0.30 g/L进行组合，对泡辣椒产品中的L1、L2和L3 3株产气微生物的抑菌率达到99.50%以上。通过验证该复配防腐剂，能控制泡辣椒产品的胀袋问题，延长产品的货架期。