陈程鹏，邱晓曼，洪厚胜，2*

(1.南京工业大学 生物与制药工程学院，南京 210009；2.南京汇科生物工程设备有限公司，南京 210009)

食醋作为一种世界性的调味品，除了用于食品的酸味调节及腌制，还被广泛用于消毒、医药和保健等方面[1]。由于地区、原料和技术的差异，醋的种类繁多。根据地域可分为东方食醋和西方食醋，东方食醋以谷物醋为主，五谷杂粮皆可为酿醋的原料；西方食醋主要为果醋和酒精醋，以葡萄、麦芽和其他水果为主要原料[2,3]。

从醋酸发酵方式上，可分为两大类：固态发酵醋和液态发酵醋。固态醋酸发酵是中国的独特工艺，其产品具有色泽优良、香味浓郁、口味醇厚等优点，但也存在生产周期长、劳动强度大、出品率低、生产规模小、生产要素难控制等问题，代表产品有镇江醋、山西老陈醋、四川保宁醋等[4]；液态发酵法在中西方食醋酿造中被广泛使用，从传统的表面静态发酵到固定化醋酸菌发酵和深层液态发酵，液态发酵具备生产周期短、劳动强度低、利用率高等特点[5]。在液态酿醋技术中，主要的酿造方法有传统的表面静态发酵法、固定化醋酸菌发酵法和深层液态发酵法等。利用深层液态发酵法酿醋标志着我国食醋行业进入现代化工业生产。

1 表面静态发酵法

表面静态发酵法是指醋酸菌在表层气液交界面上进行醋酸发酵，其制醋后一般静置发酵，属于静止发酵的一种。这是最古老的酿醋方法之一，也是目前较为普遍的一种食醋酿造工艺。在我国的《齐民要术》中就记载着21种表面静态发酵的酿醋方法[6]。在日本有60%～70%的醋采用的是表面培养技术生产的。在欧洲等地许多著名的传统品牌食醋均采用此法酿制。由于其技术简单，设备低廉，能耗较低，被广泛用于小型的制醋场所。

1.1 表面静态发酵的工艺

表面静态发酵有分批表面发酵、半连续和连续表面发酵。分批表面发酵为最常见也是最古老的醋酸发酵方法之一。在发酵过程中，醋酸菌在发酵液表面形成以纤维素为主的醋膜，仅靠菌膜中的菌体完成发酵。因此耗时较长，一般要6个月的时间才能完成醋酸发酵[7]。半连续表面发酵法是在分批发酵结束后，将发酵液不完全取出，留一部分作为种子液，添加新鲜发酵液继续发酵。其发酵成败的关键是液体表面生成的菌膜，完整的菌膜能加速发酵，缩短发酵周期。连续表面发酵是将发酵设备串联起来，使菌膜漂浮于发酵液面上，让下层液体流动，从而实现连续表面发酵。用表面发酵法生产的食醋有西班牙的雪利醋、日本的富山米醋、奥尔兰的葡萄醋、中国的富平的小米醋和福建永春红曲醋等知名品牌。

1.2 表面静态醋发酵的优缺点

表面静态发酵法的发酵周期和风味物质介于固态发酵和深层液态发酵之间，该方法是醋酸发酵由固态向液态过渡的方法，同时具备两者的诸多优点：第一，提高了风味物质，缩短了发酵周期。相对于固态发酵，醋酸发酵时间减少且风味物质较为接近。而对于深层液态发酵而言，表面静态发酵的产品风味物质丰富，气味浓郁，口味醇厚[8]。第二，操作简单，能耗低，适合大规模生产。表面静态发酵无需翻醅，无需不断搅拌，减少了人力、物力的消耗，降低了生产成本。第三，发酵过程易控制。相对于固态发酵，菌体生长和代谢产物等都均匀分布于发酵液中，在发酵过程中各参数的检测和控制都较为简易，易于实现工业化生产。第四，发酵设备相对简单，欧洲等国家常用橡木等硬质材料制作的木桶，日本米醋用陶瓷坛子，中国食醋用陶缸。表面静态发酵的不足之处在于生产速度慢，发酵周期长，有些名醋的生产需要几年甚至几十年的时间。此外，表面静态发酵所需的设备要求较高，占地面积较大，设备投资较高，生产规模有限。

2 固定化醋酸菌发酵法

固定化醋酸发酵是20世纪80年代开始发展起来的微生物工程技术，木炭等吸附性较好的天然材料最先被用于固定化醋酸菌发酵。目前，在食醋酿造行业中一般通过包埋法和吸附法对醋酸菌进行固定化[9]。包埋法是将细胞包埋在多孔材料内部，常用的载体有海藻酸盐、聚丙烯酰胺、琼脂等。吸附法是一种靠材料表面粘附力和张力固定菌体的方法，常用的有中空纤维、玉米芯、陶瓷、刨花等。任静[10]采用包埋法固定化醋酸菌，使其产酸速率达到0.48 g/(L·h)，醋酸发酵周期缩短了25%，且连续使用6批次后，发酵性能无明显变化。发酵得到的麦芽醋在感官、理化性质及卫生指标等方面与传统游离醋酸菌生产的醋液无显著差异。蒋予箭等[11]采用吸附法固定化醋酸菌，以载体的吸附能力和吸附速率为指标，对比不同载体在蓝莓果醋发酵中的差异，经10批次循环发酵，发现甘蔗渣固定醋酸菌的效果最好，且发酵过程稳定。

固定化醋酸菌发酵食醋相对其他方法具有以下优点：菌体细胞浓度高，菌体对外条件的抵抗能力强；单位体积的生物转化率高；可选出活力强、代谢能力旺盛的细胞用于发酵，提高菌体的增殖速度，缩短发酵周期；可长时间反复利用；易于实现连续化生产，且不同批次间产品的质量稳定[12-15]。

2.1 固定化载体

载体的选择作为固定化细胞技术的关键一步，直接影响了产品的质量。醋酸菌相对于其他细胞来说个体较小，直径在0.4～2.0 μm，对载体具有更高的要求。常用于固定化醋酸菌的载体有无机载体、有机合成高分子载体和天然高分子载体[16]。不同载体各有优缺点，早期研究多采用廉价易得的无机载体，后来的研究多采用有机高分子载体和天然高分子载体，具体情况见表1。

表1 固定化醋酸菌的各类载体及其特点Table 1 Carriers and characteristics of immobilized Acetobacter

2.2 固定化技术的应用和现状

固定化酶技术从20世纪中后期发展起来，具有发酵效率高、稳定性好、菌体可重复利用，产物易于分离，能实现连续性生产的特点，是当前酿醋行业中较为流行的一种方法。很多学者对固定化材料、发酵工艺等内容进行了研究，不断地发展完善固定化酿醋技术在生产上的应用。李西腾[17,18]在固定化醋酸菌制备草莓醋的研究中，发现在相同接种量的情况下，由于固定化工艺较高的产酸速率，其反应速度比传统工艺快1.7倍。随后，他在固定化发酵西瓜醋的研究中指出，发酵过程中部分醋酸菌从固定化材料中游离出来，这些游离的醋酸菌也可以将乙醇转化成为醋酸，产酸是固定化醋酸菌和游离醋酸菌共同作用的结果。孙菲菲等[19]以天然高分子材料海藻酸钠为载体，采用包埋法进行醋酸发酵制备芒果醋，研究结果与传统方法相比，产酸率提高了83%。Dias等[20]将醋酸菌和葡萄糖酸杆菌固定化后进行发酵，实验得出此方法对酒精的转化率达到74.4%。Kocher G S等[21]采用吸附法，将菌体固定于聚氯乙烯柱上进行甘蔗醋的制备。其发酵效率最高可达87.9%，产品感官良好，提高了抗坏血酸的保留率。荣智兴使用甘蔗渣、刨花和玉米芯等天然材料为菌体载体，进行制备蓝莓果醋。研究发现甘蔗渣作为固定化载体，其固定醋酸菌的速度和能力最强，产酸能力强于其他材料，产品感官品质较好，不带进异味。He等[22]利用微生物共固定化技术对改善香气的酵母和乳酸菌共固定后进行酒精发酵，然后用固定化醋酸菌进行醋酸发酵，并与传统的固态发酵和深层液态发酵所生产的食醋进行了对比，其风味物质的组成几乎与固态发酵酿造的苹果醋相似，产酸能力也接近液态深层发酵的产品。

3 深层液态发酵法

深层液态发酵法又称深层通气培养法、全面发酵法。在发酵过程中醋酸菌悬浮于发酵液，空气从发酵装置底部通入，借助强大的气流将酒液及扩培的醋酸菌进行充分搅拌，使气、液接触面积尽量加大以便进行全面的酒精氧化生成醋酸[23]。深层液态醋发酵技术是起源于欧洲的一种制醋工艺，相对于传统的固态、半固态酿醋工艺，其具有发酵效率高、易操作、生产成本低、设备占地面积小、高效的设备利用率等诸多优点[24]。早在1923年就有关于深层液态培养技术生产醋的研究，但最早应用在工业生产上的是在青霉素的生产上。Hromatka和Ebner将搅拌装置固定在发酵罐的底部，开发出醋酸液态深层发酵装置Acetator，并成功用于工业化生产，这就是后来闻名于世的Frings醋化器[25]。1952年，Marhof等用Waldhof型发酵槽酿醋成功。1959年Cohee和Steffen开发了Cavitator连续发酵装置。我国起步较晚，于20世纪70年代才开始研究，最初由石家庄珍极公司应用于醋酸的发酵。1978年上海粮油工业公司等首次将300 L自吸式发酵罐应用于酿醋，随后又将其进行放大生产[26]。

深层液态发酵工艺与中国传统食醋酿造工艺相比，不足和优势都非常明显。在口味感官上，该工艺产品与中国传统食醋产品有比较大的差距，由于酿醋周期太短，酿醋色泽较淡，且缺乏食醋独特的芳香。但在生产效率和原料使用率上要远远优于国内传统醋发酵工艺，同时由于不需要添加稻壳和麸皮等辅料，减少了生产的成本，对于那些受到场地等原因限制的企业来说，采用深层液态醋发酵是不错的选择。

3.1 深层液态发酵工艺

根据操作方式的不同，深层液态发酵工艺可以分为分批发酵、连续发酵和半连续发酵3种方式。分批发酵是最为基础的发酵方式，由于其每批发酵都需制备种子液，大大延长了发酵周期，因此常用于实验室研究，在实际生产过程中应用的较少。连续发酵是实现补料与卸料同步进行的一种发酵方式。在发酵的过程中，尽可能截留流出醋液中的菌体，增加发酵液中的醋酸菌浓度，提高醋酸的生产力。连续发酵尽管更为节约成本，但其面临菌种老化、出料中底物残留量较高等问题，仍无法实现大规模的工业化生产。半连续发酵是指在分批发酵的基础上，当发酵液中乙醇转化为醋酸到规定指标，放罐后在罐内保留1/2～1/3的发酵液，再补充等体积新鲜发酵液，从而保持发酵液总体积不变，进行下次发酵，如此反复[27]。半连续发酵在卸料时要速度快，在补充新鲜发酵液时应逐步缓慢添加，避免环境条件急剧变化。与其他两种方式相比，半连续发酵不仅提供了充足的菌种及其发酵所需的底物和养分，避免了菌种老化，还稀释了发酵液中较高浓度的醋酸，缓解了醋酸对菌体生长的抑制作用，有利于保持菌体维持较高的活力，提高产酸速率。半连续发酵是当今食醋工业化生产中较为普遍的发酵方式，目前国外80%以上的食醋企业均采用该发酵方式进行大规模的食醋生产。

3.2 影响深层液态发酵的因素

深层液态发酵是在发酵过程中强制通风搅拌，连续通入空气直至发酵结束，是快速制醋法的一种。由于其具有成本低，易操作，设备密封性较高，能维持纯种发酵，研究问题易入手，发酵后的醋液经过滤后不易形成沉淀等诸多优点，因此大多数的学者在研究液态醋发酵工艺时，多采用深层液态发酵法。深层液态发酵在操作过程中主要应注意通气供氧、控温、判别发酵终点及大量气泡的去除等问题[28]。

3.2.1 通气供氧

醋酸菌是严格好氧菌，在深层培养中溶氧对醋酸菌的影响十分重要。缺氧的破坏程度随含酸量的增加而增大，会使得菌体细胞的耐酸性降低。殷海松等[29]研究了供氧对醋酸菌发酵的影响，发现在菌体生长和醋化乙醇时需要消耗大量的溶氧，特别是产酸高峰期对溶氧的消耗更大。强化供氧后，细胞内ATP浓度提高了302%，满足了菌体快速生长和适应高酸环境对能量的需求，提高了菌体对醋酸的耐受性，从而提高了菌体浓度和产酸速率。向东等分别采用静置、底部供氧、间歇式供氧、改进供氧系统4种培养方式，研究供氧方式对生物量的影响。结果表明，生物量并未随溶氧量的增大而增大。因此并不是供氧量越大越好，有时过量供氧还会抑制菌体的生长以及增加生产成本，因此选择适宜的供氧量才能促进发酵生产。此外，过多地在发酵液中通气，会使发酵液中的挥发性物质，如发酵前乙醇、中间产物乙醛和生成的醋酸大量蒸发，使生产率降低。

3.2.2 温度控制

醋酸菌生长和发酵时对温度的要求较为严格，常用的一些醋酸菌，无论是表面静态发酵还是深层液态发酵醋酸，最适温度都在30 ℃左右。若温度提高2～3 ℃，都会导致醋酸发酵终止或发酵速率下降[30]。在深层液态发酵中，由于大量发酵生物热的产生，因此维持某一阶段温度的恒定也是生产顺利进行的必要条件之一。

3.2.3 合适的放罐指标

当深层液态发酵达到发酵终点时，由于乙醇被完全消耗而溶解氧充足，醋酸菌将通过三羧酸循环，氧化醋酸为水和二氧化碳，这个过程被称为醋酸过氧化。醋酸菌的醋酸过氧化作用是醋酸菌维持生命的正常生理需要，但在实际工业生产中是必须要避免的现象。因此确定合理的放罐时机是确保顺利生产的重要因素之一。为了防止醋酸过氧化，应在发酵液中乙醇含量为0.1%～0.3%(V/V)时就停止发酵，因此，要定期对发酵液进行分析，根据经验和数学模型可准确预测发酵结束时间，减少醋酸的消耗，提高生产效益。

4 总结与展望

中国是食醋的生产大国，也是消费大国。为满足社会市场需求，液态酿醋技术被广泛运用于实际生产。其发酵过程具备周期短、利用率高等特点，为中国的食醋企业带来了巨大的经济效益。各地企业纷纷对液态发酵中使用的菌种、发酵工艺、设备及材料等进行了大量的研究，在维持快速发酵的同时，改善了发酵条件，提高了产品中的风味物质。

随着酿醋技术研究的深入与开发，今后的酿醋设备更趋向于机械化、自动化、智能化，高效的连续化生产工艺也是未来酿醋技术前进的必然方向。目前，我国的酿醋技术与国外先进的酿醋技术相比还有一定的差距。随着国内研究的不断深入，必将推进高效菌种的改造，自动化生产设备的完善，检测与控制系统的开发与改进，使我国的食醋酿造工业进入世界先进行列。