黎程凤，秦磊磊 ，杨年华 ，李素媛 ，王应喜 ，胡飞飞，邓张双，，*

(1.三峡大学天然产物研究与利用湖北省重点实验室，湖北 宜昌 443002；2.三峡公共检验检测中心，国家磷产品质量监督检验中心，湖北 宜昌443002；3.湖北土老憨调味食品股份有限公司，湖北 宜都 443302)

柑橘醋是以宜昌市出产的新鲜、成熟的柑橘类水果为原料，经多重工艺发酵而得，具有柑橘的独特风味和天然色泽[1]。柑橘果醋相比粮食酿制的食醋营养更丰富，维生素及生物活性物质更多，具有很好的抗氧化能力[2]，产品附加值高，商业价值高，同时对促进我国柑橘产业的发展也具有积极意义。

柑橘作为柑橘醋的发酵原料，其大部分的营养成分也将在柑橘醋中保留，研究显示柑橘类水果多富含黄酮类化合物[3]，具有增强人体免疫能力、抑菌消炎、预防糖尿病以及心血管疾病等功效[4]。黄酮类化合物指的是两个具有酚羟基的苯环同中间三碳相互连接而成的一系列化合物[5]，大多数具有2-苯基色原酮(C6-C3-C6)的基本骨架，目前在柑橘中已鉴定出来约60多种黄酮类化合物，主要归属于黄烷酮、黄酮、黄酮醇和花青苷四大类[6]。柑橘果实中还存在一系列多甲氧基黄酮(PMFs)，该系列化合物在黄酮骨架上含有4个以上甲氧基基团，其中橘皮素、川陈皮素、5-去甲基川陈皮素等多甲氧基黄酮是柑橘属植物表皮的特有成分[7]，柑橘类果实中由于黄酮以及多甲氧黄酮含量分布的差异，果实营养成分以及质量标准也存在一定的差异[8]。

本实验中将对柑橘醋中指标性黄酮类化合物进行分离和鉴定，同时对柑橘醋中指标性化合物含量及总黄酮含量进行检测，分析黄酮类化合物含量与总黄酮含量的关系，更好地了解柑橘醋的特性，对醋的质量进行监控，提高产品的品质。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 样品

柑橘醋原浆(成品)：由湖北省宜昌市湖北土老憨生态农业集团出品。

1.1.2 材料与试剂

乙酸乙酯(分析纯)：天津市恒兴化学试剂有限公司；甲醇(分析纯)：国药集团化学试剂有限公司；无水乙醇(分析纯)：天津市天力化学试剂有限公司；甲醇(色谱纯)：美国Tediatedia公司；水：华润怡宝饮料(中国)有限公司；芦丁标准品(批号161219)：北京世纪奥科生物技术有限公司；亚硝酸钠(分析级)、硝酸铝(分析级)：天津市光复科技发展有限公司；氢氧化钠(分析级)：天津市博迪化工有限公司；没食子酸标准品(实验室自制)：现存于湖北省宜昌市三峡大学天然产物重点实验室；浓度1 mol/L H+福林-酚显色剂(分析纯)：天津市光复精细化工研究所；碳酸钠(分析纯)：西陇化工股份有限公司；蒸馏水。

1.1.3 仪器与设备

FA2204B万分之一电子分析天平 上海越平科学仪器有限公司；N-1100旋转蒸发仪 日本EYELA仪器公司；1525EF 高效液相色谱仪 美国Waters公司；Dionex Ultimate 3000高效液相色谱仪 美国DIONEX公司；Bruker-ARX-400核磁共振波谱仪；微孔滤膜(有机相，0.22 μm)；25 μL微量进样针 上海高鸽工贸有限公司；分析型色谱柱(YMC-Pack ODS-A C18，100 Å，4.6 mm×250 mm×5 μm)；制备型色谱柱(YMC-Pack ODS-A C18，100 Å，10 mm×250 mm×5 μm)；柱层析硅胶(200～300目)；D-101大孔吸附树脂；薄层层析硅胶板(200 mm×200 mm) 青岛海洋化工厂；10 mL容量瓶、100 mL容量瓶、移液管、天波量筒；石英比色皿；UV-3010型紫外可见分光光度计 日本Hitachi公司。

1.2 方法

1.2.1 黄酮类化合物分离鉴定

对于柑橘醋中黄酮类化合物的分离提取方法有很多，包括溶剂萃取法、超声波辅助醇提法、微波辅助醇提法、二氧化碳超临界流体萃取法等[9-12]，由于本实验样品为液态，因此采用有机溶剂乙酸乙酯对柑橘醋样品进行萃取。

取4 L柑橘醋样品，采用10 L乙酸乙酯溶剂对样品反复萃取、静置、浓缩，得到乙酸乙酯部分浸膏10.4 g。将乙酸乙酯浸膏通过D-101大孔吸附树脂层析柱(流动相：乙醇和水)粗分离，经10%、30%、50%、70%、90%、100%乙醇梯度冲洗，按浓度梯度旋蒸浓缩，得到Fr.1～Fr.6号粗浸膏，分别取适量样品用60%甲醇溶解，微孔滤膜过滤后各取10 μL通过高效液相色谱仪进行分析(流动相：甲醇/水10%～100%，紫外吸收波长：220 nm，运行时间：30 min)，选取其中化合物含量较多的Fr.2号和Fr.3号片段进行正向硅胶柱二次分离(流动相：甲醇/二氯甲烷)，梯度冲洗得到Fr.2-1～Fr.2-15以及Fr.3-1～Fr.3-14共29个片段，选取Fr.2中Fr.2-12号，Fr.3中Fr.3-3号通过高效液相色谱仪进行制备，得到化合物2-12-1、3-3-2、3-3-3，核磁共振鉴定3个化合物结构，经与文献对比分析可知3种化合物分别为：柚皮苷[13]、柚皮素[14]、橙皮素[15]。

将柑橘醋乙酸乙酯萃取物通过高效液相色谱仪进行分析(流动相：甲醇/水10%～100%梯度冲洗，紫外吸收波长：220 nm，运行时间：60 min)，分析结果见图1。在同一样品中，柚皮苷、柚皮素、橙皮素这3个化合物分离度好，基线分离效果好，保留时间同标准品对比差异小，样品峰纯度高，证明上述液相分析条件可用于柑橘醋中黄酮类化合物柚皮苷、柚皮素、橙皮素含量的测定，3个化合物各自保留时间分别为28.07，36.54，37.44 min。

图1 柑橘醋半成品乙酸乙酯浸膏高效液相分析色谱图Fig.1 HPLC chromatogram analysis of semi-finished ethyl acetate extract of citrus vinegar

1.2.2 黄酮类化合物含量测定

1.2.2.1 柚皮苷含量检测方法

a.标准品溶液和样品溶液的配制

将分离出的2.6 mg柚皮苷标准品用60%色谱甲醇溶液稀释定容至1 mL容量瓶中，得到柚皮苷标准品母液浓度为2.6 mg/mL。

取柑橘醋原浆溶液25 mL，用100 mL乙酸乙酯进行萃取，剧烈振摇3 min后，静置1 min，取乙酸乙酯部分，干燥浓缩得到浸膏，用60%甲醇溶液稀释定容至10 mL容量瓶中，得到样品溶液。

b.绘制标准曲线

用移液枪从柚皮苷标准品母液中精确吸取标准品溶液25，50，100，150，200 μL，分别置于1 mL容量瓶中用60%甲醇溶液定容，得到0.065，0.13，0.26，0.39，0.52 mg/mL 5个不同浓度的标准溶液，各取10 μL样品进入高效液相经分析柱按上述分析条件进行分析，标准品保留时间为28.0 min。每份标准溶液进样2次，其峰面积平均值为纵坐标(Y轴)，标准品浓度为横坐标(X轴)，绘制标准曲线，得到标准曲线方程：y=0.0035x-0.0052；R2=0.9991。

c.样品含量测定

取10 μL样品溶液进入高效液相分析，分析条件同上，保留时间28 min左右的色谱峰即为柚皮苷样品峰。将测量峰面积带入上述标准曲线方程，测得浓度，经计算得样品柚皮苷含量。

d.计算

样品柚皮苷含量计算公式：

1.2.2.2 柚皮素含量检测方法

a.标准品溶液和样品溶液的配制

将分离出的12.5 mg柚皮素标准品用色谱甲醇溶液稀释定容至10 mL容量瓶中，得到柚皮素标准品母液浓度为1.25 mg/mL。

样品溶液的配制方法同上。

b.绘制标准曲线

用移液枪从母液中精确吸取100，250，500，1000 μL的标准品溶液1.5 mL，分别置于10 mL容量瓶中，用100%甲醇溶液定容，得到0.0125，0.03125，0.0625，0.125，0.1875 mg/mL 5个不同浓度的标准溶液，各取10 μL样品进入高效液相经分析柱按上述分析条件进行分析，标准品保留时间为36.0 min。每份标准溶液进样2次，其峰面积平均值为纵坐标(Y轴)，标准品浓度为横坐标(X轴)绘制标准曲线，得到标准曲线方程：y=0.0023x+0.001；R2=0.9999。

c.样品含量测定

样品溶液按上述条件分析，保留时间36 min左右的色谱峰即为柚皮素样品峰。将测量峰面积带入上述标准曲线方程，测得浓度，经计算得样品柚皮素含量。

d.计算

样品柚皮素含量计算公式：

1.2.2.3 橙皮素含量检测方法

a.标准品溶液和样品溶液的配制

将分离出的橙皮素标准品5.7 mg用色谱甲醇溶液将标准品稀释定容至10 mL容量瓶中，得到橙皮素标准品母液浓度为0.57 mg/mL。

样品溶液的配制方法同上。

b.绘制标准曲线

用移液枪从母液中精确吸取250，500，1000 μL的标准品溶液1.5，2 mL，分别置于10 mL容量瓶中，用100%甲醇溶液定容，得到0.01425，0.0285，0.057，0.0855，0.114 mg/mL 5个不同浓度的标准溶液，各取10 μL样品进入高效液相经分析柱按上述分析条件进行分析，标准品保留时间为36.0 min。每份标准溶液进样2次，其峰面积平均值为纵坐标(Y轴)，标准品浓度为横坐标(X轴)，绘制标准曲线，得到标准曲线方程：y=0.0027x+0.0024；R2=0.9992。

c.样品含量测定

样品溶液按上述条件分析，保留时间37 min左右的色谱峰即为橙皮素样品峰。将测量峰面积带入上述标准曲线方程，测得浓度，经计算得样品橙皮素含量。

d.计算

样品橙皮素含量计算公式：

1.2.3 总黄酮含量测定方法

2 结果与讨论

2.1 化合物结构鉴定

化合物柚皮苷，为黄色粉末(CH3OH)，化合物分子式为C27H32O14。13C NMR (100 MHz,DMSO-d6) δ:198.2(C-4),163.9(C-7),166.0(C-2),163.7(C-4′),163.6(C-5),158.8(C-9),129.526(C-2′), 129.4(C-6′),116.2(C-1′),116.2(C-3′,5′),106.2(C-10),104.3(C-3),101.6(C-1‴),100.3(C-6),100.3(C-1″),96.4(C-8),79.6(C-3‴),79.5(C-2″),77.2(C-3″),76.5(C-5″),73.9(C-5‴),73.0(C-4‴),71.7(C-2‴),71.2(C-4″),66.9(C-6″),18.8(C-6‴)。

化合物柚皮素，为黄色粉末(CH3OH) ，化合物分子式为C15H12O5。13C NMR (DMSO-d6,100 MHz) δ:196.6(C-4),167.8(C-7),163.9(C-5),163.4(C-9),158.2(C-4′),129.4(C-1′),128.8(C-2′,6′), 115.6(C-3′,5′), 102.0(C-10),96.4(C-6),95.6(C-8),78.8(C-2),42.5(C-3)。

化合物橙皮素，为黄色粉末(CH3OH) ，化合物分子式为C16H14O6。13C NMR (DMSO-d6,100 MHz)δ:196.6(C-4),167.3(C-7),163.9(C-5),163.3(C-9),148.4(C-4′),146.9(C-3′),131.6(C-1′),118.1(C-6′),114.5(C-2′),112.4(C-5′),102.2(C-10),96.3(C-6),95.5(C-8),78.7(C-2),56.1(4′-OCH3),42.6(C-3)。

2.2 黄酮类化合物含量

2.2.1 样品柚皮苷含量

取9个批次样品溶液各3份进入高效液相按上述检测条件分析，将3次样品测得峰面积带入标准曲线方程 y=0.0035x-0.0052，测得浓度，带入公式进行换算，取其平均值即为样品柚皮苷含量，见表1。

表1 9个不同批次柑橘醋样品柚皮苷含量Table 1 Content of naringin in 9 different batches of citrus vinegar

测得9个批次柑橘醋样品柚皮苷含量最高为134.1 mg/L，最低为57.7 mg/L，9个批次样品相对标准偏差平均值为0.22%，该检测方法准确性与重复性高。

2.2.2 样品柚皮素含量

取9个批次样品溶液各3份进入高效液相按上述检测条件分析，将3次样品测得峰面积带入标准曲线方程y=0.0023x+0.001，测得浓度，带入公式进行换算，取其平均值即为样品柚皮素含量，见表2。

表2 9个不同批次柑橘醋样品柚皮素含量Table 2 Content of naringenin in 9 different batches of citrus vinegar

测得9个批次柑橘醋样品柚皮素含量最高为28.3 mg/L，最低为9.9 mg/L，9个批次样品相对标准偏差平均值为0.88%，该检测方法准确性与重复性高。

2.2.3 样品橙皮素含量

取9个批次样品溶液各3份进入高效液相按上述检测条件分析，将3次样品测得峰面积带入标准曲线方程y=0.0027x+0.0024测得浓度，带入公式进行换算，取其平均值即为样品橙皮素含量，见表3。

表3 9个不同批次柑橘醋样品橙皮素含量Table 3 Content of hesperitin in 9 different batches of citrus vinegar

测得9个批次柑橘醋样品橙皮素含量最高为20.7 mg/L，最低为6.1 mg/L，9个批次样品相对标准偏差平均值为0.99%，该检测方法准确性与重复性高。

2.3 总黄酮含量

取9个批次柑橘醋(成品)按上述方法检测，将5次测得样品吸光度带入标准曲线方程y=16.858x-0.2014，测得浓度，带入公式进行换算，取其平均值即为样品总黄酮含量，见表4。

表4 9个批次柑橘醋(成品)总黄酮含量Table 4 Total flavonoids content of 9 batches of citrus vinegar (finished product)

测得9个批次柑橘醋样品总黄酮含量最高为640.9 mg/L，最低为449.1 mg/L，9个批次样品相对标准偏差平均值为1.85%，该检测方法准确性与重复性高。

3 结论

本实验采用大孔吸附树脂、正相硅胶色谱以及制备型HPLC等分离方法，从柑橘醋乙酸乙酯萃取物中分离鉴定出柑橘醋中指标性化合物柚皮苷、柚皮素、橙皮素，证明这3种化合物的含量及比例分配可以有效地反映出柑橘醋发酵质量。采用亚硝酸钠-硝酸铝-氢氧化钠显色法对柑橘醋成品中总黄酮含量进行测定。通过对9个批次柑橘醋成品总黄酮含量进行测定测得：9个批次柑橘醋样品总黄酮含量为449.1～640.9 mg/L，相对标准偏差平均值为1.85%，证明该检测方法重复性高，加标回收率测定结果相对标准偏差为1.96%，<2%，证明该方法具有良好的准确性，适用于柑橘醋中总黄酮含量的测定。

对9个批次样品中柚皮苷、柚皮素、橙皮素含量及总黄酮含量进行分析。其中4号和8号两个批次总黄酮含量较其他批次高，其柚皮素与橙皮素含量与其他批次相比较低，柚皮苷含量较高；2号和9号两个批次样品总黄酮含量较其他批次低，其柚皮素与橙皮素含量与其他批次相比较高，柚皮苷含量偏低。证明样品总黄酮含量的高低与样品中柚皮苷、柚皮素、橙皮素的含量及比例分配存在一定关系，总黄酮含量的高低与柚皮苷含量呈正比例关系，与柚皮素、橙皮素的含量呈反比例关系。但其中3号批次样品实验结果不符合上述结论，其总黄酮含量低于其他批次样品，但其柚皮苷高于部分批次样品，柚皮素与橙皮素含量也较低。对于这一反常情况，我们通过文献调研了解到，柚皮素和橙皮素两种化合物均难溶于水，根据实验研究显示，在柑橘醋发酵的过程中能溶于水的柚皮苷会转化为难溶于水的柚皮素、橙皮素产生沉淀，导致柑橘醋成品中柚皮素与橙皮素含量低。因此，柑橘醋中黄酮类化合物的含量与总黄酮含量的关系还需要多项实验结果综合分析，并对更多批次样品检测结果统计分析进行确定。

在后期实验中还需要对柑橘醋发酵过程中的沉淀物进行分析，了解柑橘醋发酵过程中化合物的变化。同时对大量批次的柑橘醋样品进行上述实验分析，得到统计学数据以验证目前所得的结论，对于分析柑橘醋中黄酮类化合物的含量与总黄酮含量的关系以及在工业上对柑橘醋质量分析进行进一步的研究。