金 华 张 磊 王亿平 吕 勇 王 东 王立媛 章雪莲 胡 岚 包娅琼 高雅晨

(安徽中医药大学第一附属医院肾病科，合肥 230031)

慢性肾小球肾炎(Chronic glomerulonephritis，CGN)的主要临床表现是蛋白尿、血尿、高血压、水肿；其病程进展缓慢，可伴随不同程度的肾功能减退的一组肾小球疾病[1]。CGN因其病程长、易反复，加之激素和免疫抑制剂的使用，副作用大且多，疗效不一；并且是中国患者终末期肾病的首位病因(约占50%)[2]。一旦进入终末期肾病会给患者及当今社会带来沉重的医疗负担，有效的防治CGN也是中医药防治肾病工作者关注和研究的热点。前期研究证实，中药复方参地颗粒可以有效缓解CGN不同病理类型脾肾亏虚证患者的临床症状、消减尿蛋白[3]，同时对患者的T细胞亚群和外周单个核细胞B7-1介导的免疫紊乱均有一定的调节作用[4,5]。

外周血单个核细胞(Peripheral blood monouclear cells，PBMC)的沉积与凋亡，是导致自身免疫紊乱[6]及抗原-抗体复合物在肾脏聚集的重要原因[7]。单核细胞趋化蛋白-1(Methylcyclopropene-1，MCP-1)具有趋化并激活外周血单个核细胞的作用。MCP-1在肾脏的高表达中不但能够激活更多的炎症细胞浸润，还能直接刺激肾脏固有细胞分泌更多的促炎症因子和细胞外基质(Extracellular matrix，ECM)的合成，加重肾小球的炎症反应[8]。而转化生长因子-β1(Transformation growth factor-β1，TGF-β1)在促进ECM的蓄积、肾小球硬化中起着重要的调控作用，当其过度表达时还可导致肾组织纤维化[9]。因此基于PBMC凋亡及MCP-1、TGF-β1的表达，故开展本次观察研究进一步明确参地颗粒在CGN中的干预作用，为其临床应用及后续深入的研究提供依据。

1 材料与方法

1.1材料 全自动酶标仪(型号：Multiskan MK3，厂家：Thermo scientific)；流式细胞仪(型号：FC 500，厂家：BECKMAN COULTER)；人外周血单个核细胞分离液(型号：LTS1077)购自天津灏洋；Bcl-2抗体(型号：12789-1-AP)、Fas抗体(型号：13098-1-AP)购自Proteintech；MCP-1 ELISA试剂盒(型号：R-EL-R0633c)、TGF-β1 ELISA试剂盒(型号：R-EL-R0084c)购自Elabscience。

1.2研究方法

1.2.1诊断标准 西医诊断标准:①慢性肾炎诊断标准：参照王海燕主编的《肾脏病学》[10]。②慢性肾脏病分期标准：参照2012年国际肾脏病组织“肾脏病：改善全球预后”(Kidney disease：improving global outcomes，KDIGO)[11]分期标准。GFR的估算依据慢性肾脏病流行病学合作研究(CKD-EPI)公式[12]。③中医证候-脾肾亏虚证诊断标准：参照《中药新药临床研究指导原则》[13]中的标准。

1.2.2病例选择标准 (1)纳入标准：①符合西医学CGN诊断标准及中医脾肾亏虚证候诊断标准；②符合慢性肾脏病Ⅰ、Ⅱ期(eGFR>60 ml/min)；③24 h尿蛋白定量小于3 g；④年龄为18～70岁。(2)排除标准：①不符合病例纳入标准者；②合并有心、脑疾病或严重传染病者；③正在服用激素、细胞毒药物者；④妊娠或哺乳期妇女；⑤生活不可自理或患精神疾病，不能按规定服药者；⑥资料不全，无法判断疗效者。(3)剔除标准：①受试者依从性差(试验用药依从性<80%或>120%)，中途停药、换药、加药，或合并使用本方案禁止的中西药物；②服用了受试方案外的药物影响疗效和安全性判定。(4)终止标准：①治疗过程中出现严重的不良事件和合并症，导致无法继续接受治疗者；②失访或自行退出实验者；③严重违反本次实验方案用药者。

1.2.3病例收集及分组 本研究为前瞻性随机对照研究，收集2017年3月至2017年12月在安徽中医药大学第一附属医院肾内科就诊的CGN脾肾亏虚证患者，采用随机数字表法，治疗组和对照组按照(1∶1)分配入组，本研究经安徽中医药大学第一附属医院伦理委员会批准，批号：2017AH-04，所有患者签署知情同意书。同时在中国临床试验注册中心网上注册-注册号ChiCTR-INR-17011060。本研究共纳入符合标准的患者60例，随机分为对照组和治疗组各30例，治疗组有1例患者于外院接受泼尼松治疗，对照组有2例于外院接受雷公藤多甙治疗，故剔除；最终完成本次实验的患者者总数为57例，治疗组29例，男16例，女13例，平均年龄(39.02±12.58)岁，平均病程(3.45±1.22)年；对照组28例，男15例，女13例，平均年龄(39.35±11.03)岁，平均病程(3.26±1.35)年；另外从我院体检中心纳入20例健康体检人员作为正常组，平均年龄(40.33±10.18)岁。三组患者一般资料差异无统计学意义(P>0.05)。

1.2.4干预措施 治疗组服用参地颗粒(生产批号：20140418)，由红参、熟地、五味子、川芎等药物组成，统一由安徽中医药大学第一附属医院加工制造，每次10 g，每日3次；对照组服用缬沙坦胶囊(诺华制药)，规格：80 mg/粒，每日80 mg，疗程12周。两组患者均予以低盐低脂饮食，积极控制血压(<140/90 mmHg)。降压药物首选钙通道阻滞剂，若血压控制不能达标，依次加用β受体阻滞剂、α受体阻滞剂、中枢性降压药等。

1.2.5观察指标 (1)中医证候疗效，参照《中药新药临床研究指导原则》[13]，依据中医症候积分值分为临床痊愈、显效、有效、无效。(2)于访视1至访视4共检查4次24 h UPr；常规生化法检测Scr及BUN水平，并估算eGFR，于访视1、访视4各检查1次。(3)运用流式细胞仪检测PBMC凋亡率；Western blot法检测PBMC凋亡调控蛋白Bcl-2、Fas的表达；ELISA法检测血清MCP-1、TGF-β1表达水平，分别于访视1、访视4各检查1次。

2 结果

2.1中医症候疗效比较 治疗组总有效率为93.10%，对照组为67.85%，治疗组优于对照组(P<0.05)，见表1。

2.2治疗前后24 h尿蛋白定量水平比较 治疗前两组患者24 h尿蛋白定量比较无明显差异(P>0.05)；治疗第8周和第12周两个时点比较，治疗组降低24 h尿蛋白定量的作用优于对照组(P<0.05)；治疗组的疗效与治疗时间呈正相关，见表2。

2.3肾功能水平比较 两组患者治疗前后肾功能水平变化差异无统计学意义(P>0.05)，见表3。

2.4PBMC凋亡率及凋亡调控蛋白Bcl-2、Fas水平比较 CGN患者PBMC凋亡率及Fas表达较正常人群高(P<0.01)；治疗后CGN患者的PBMC凋亡率及Fas表达较治疗前低(P<0.05)，且治疗组低于对照组(P<0.05)。CGN患者PBMC中的Bcl-2表达较正常人群减少(P<0.01)；治疗后其表达增加(P<0.05)；且治疗组升高水平更高，优于对照组(P<0.05)，见表4，图1。

表1 中医证候疗效比较

Tab.1 Comparison of therapeutic effects of TCM syndrome

GroupsnClinical recoverMarkedly effectiveEffectiveInvalidTotal effective rate(%)Control group28469967.85%Treatment group298712293.10%

GroupsnBefore treatmentWeek 4Week 8Week 12Control group 281.16±0.311.03±0.302)0.94±0.322)0.79±0.322)Treatment group 291.18±0.241.01±0.251)2)0.90±0.251)2)0.71±0.251)2)

Note：Comparisons with control group，1)P<0.05；comparisons with before treatment，2)P<0.05.

GroupsScr(μmol/L)Before treatmentAfter treatmentBUN( mmol/L)Before treatmentAfter treatmenteGFR(ml/min)Before treatmentAfter treatmentControl group 63.5±3.5560.6±4.315.62±0.545.67±0.5984.31±6.7582.23±7.21Treatment group 62.7±4.2163.4±2.145.70±0.685.24±0.8582.56±6.6182.51±6.39

GroupsnPBMC Apoptotic rate(%)Before treatmentAfter treatmentBcl-2Before treatmentAfter treatmentFasBefore treatmentAfter treatmentNormal group2011.39±1.05-0.21±0.02-0.03±0.006- Control group 2941.36±3.531)32.58±5.242)0.11±0.031)0.14±0.012)0.06±0.0081)0.05±0.0092)Treatment group2841.62±5.371)27.86±6.722)3)0.13±0.031)0.18±0.012)3)0.08±0.0061)0.04±0.0092)3)

Note：Apoptotic rate %=early apoptotic rate %+late apoptotic rate%；Comparisons with normal group，1)P<0.01；comparisons with before treatment，2)P<0.05；comparisons with control group，3)P<0.05.

GroupsnMCP-1Before treatmentAfter treatmentTGFβ-1Before treatmentAfter treatmentNormal group20235.48±10.05-141.54±15.76-Control group 29277.89±9.441)262.14±12.422)211.07±18.701)193.95±28.582)Treatment group28275.61±11.581)253.32±15.512)3)211.12±17.321)171.52±16.522)3)

Note：Comparisons with normal group，1)P<0.05；comparisons with before treatment,2)P<0.05;comparisons with control group,3)P<0.05.

图1 PBMC细胞表达流式图Fig.1 PBMC cell expression flow chart

2.5血清MCP-1、TGF-β1表达水平比较 CGN患者血清MCP-1、TGF-β1的表达较正常人增多(P<0.05)；治疗后患者MCP-1、TGF-β1水平下降(P<0.05)，且治疗组优于对照组(P<0.05)，见表5。

3 讨论

慢性肾炎按其临床证候表现不同，可归属于“慢肾风”、“尿浊”、“水肿”、“虚劳”等范畴。慢性肾炎的病因病机历代各医家观点各有不同，但均认为其本在于脾肾亏虚这一病机。课题组长期致力于中医药防治肾脏疾病的基础与临床，并且总结出了该病的基本病机乃脾肾亏虚为本，湿热、瘀血为标[14]。基于这一病机，采用出自清朝新安医学名医程林删定的《圣济总录纂要·卷十三·虚劳门》中的人参汤加减治疗CGN[15]，在取得临床疗效后，进一步总结出参地颗粒，方中人参补脾益肺、益肾助阳，固摄精微为君；茯苓、熟地健脾益肾，五味子养阴固精，桑螵蛸固精缩尿，鸡内金摄精止遗，共为臣药；川芎活血化瘀，为佐使之用，全方共奏健脾益肾、固摄精微之功，又兼顾化瘀之法。前期临床观察研究证实参地颗粒对于脾肾亏虚证CGN不仅有良好的临床疗效，同时对患者的异常免疫炎症状态有一定的纠正作用[3-5,16,17]，本次研究再次证实了参地颗粒的临床疗效同时也展现出参地颗粒在CGN患者PBMC凋亡及MCP-1、TGF-β1的异常表达上的调节力度。

PBMC凋亡相关因子，能够通过激活上皮细胞的凋亡通路，提高上皮细胞的程序性凋亡的风险，PBMC还能够诱导外周血中淋巴细胞活性的改变，促进自然杀伤性T 淋巴细胞对于自身组织的损伤，加剧自身重要内脏器官组织的损伤和功能障碍。PBMC在诱导细胞核DNA基因的转录障碍、抑制上皮细胞周期的调控异常等方面发挥了重要作用，从而促进了功能性细胞的凋亡和间质成分的增生[18]。在慢性肾炎的发生发展过程中，肾脏组织中的自然凋亡细胞不能被单核巨噬细胞清除，结果导致了这些凋亡细胞的二次凋亡坏死，自身抗原成分核酸和核酸相关蛋白就从这些二次凋亡细胞的细胞核中释放出来，沉积于肾小球，针对这些核自身抗原成分的刺激产生了相应的自身抗体，从而导致肾小球的免疫性损伤[19]。在损伤因素刺激下，肾小管上皮细胞的增殖与凋亡异常导致了肾纤维化的发生发展[20]。本次研究发现CGN患者PBMC凋亡率较正常人群高，提示CGN患者存在PBMC凋亡的过度激活，这可能参与了CGN的发病过程。

Fas及Bcl-2蛋白作为经典的凋亡调节蛋白，Bcl-2可以通过阻止由Fas、Fadd/Mort1和Caspase8组成的死亡诱导信号复合物的形成，抑制Fas诱导细胞凋亡的发生发展[21]。本次研究发现CGN患者存在PBMC凋亡的过度激活，同时PBMC中Fas表达较正常人群高，而Bcl-2表达较正常人群减少。Fas作为一种跨膜蛋白，与其相应的配体FasL结合即可激活致死性转导信号通路，引发细胞死亡。Fas-FasL通路是比较典型的引起细胞凋亡的膜受体通路[22]。Bcl-2家族中有众多成员，各成员根据其结构及功能的不同分为促细胞死亡的负调因子和抑制细胞死亡的正调因子两大类，当细胞被外界信号刺激时，正调因子可保护细胞免于凋亡坏死。凋亡调控蛋白Bcl-2主要分布于细胞核的胞质面、内质网和线粒体外膜上，在内源性信号通路中起重要作用[23]。参地颗粒可以有效减少PBMC凋亡率及Fas表达，提高Bcl-2表达。

PBMC凋亡的过度激活，可以诱导炎症因子及趋化因子MCP-1的过度分泌，并且与肾脏损伤程度呈正相关。MCP-1可由各种致炎细胞因子刺激单核细胞、巨噬细胞、内皮细胞、成纤维细胞等诱导分泌，而MCP-1又可通过上调单核-巨噬细胞及炎症细胞因子等的表达来启动或扩大炎症反应[24]。研究发现MCP-1的表达下调还可改善肾间质巨噬细胞浸润的微环境，具有改善肾间质纤维化的作用[25]。转化生长因子-β家族(TGF-β)在细胞生长和分化中起重要的调节作用，在酸性环境或蛋白裂解环境中均可活化TGF-β，TGF-β1是其中一个亚型，研究表明TGF-β1是一种强有力的致纤维化因子，过度表达的TGF-β1可促进肾脏细胞外基质的产生和抑制细胞外基质蛋白的水解，参与肾间质纤维化的整个过程。另外其还可诱导肾小管上皮细胞生长停滞和凋亡[26]。TGF-β1水平可以一定程度反映肾脏损伤的程度，本次研究中CGN患者血清MCP-1、TGF-β1的表达较正常人增多，经治疗干预后水平较前降低。

综上所述，参地颗粒可明显改善CGN脾肾亏虚证患者的临床症状，消减尿蛋白。其机制可能是通过上调PBMC凋亡调控蛋白Bcl-2的表达，下调Fas蛋白的表达，降低PBMC凋亡率，减少相应的自身抗体产生，下调血清炎症因子MCP-1、TGF-β1的表达，减轻肾脏的免疫炎症反应，减轻肾脏病理损害。