张建锋 时艳华 王献红 李建华 张洪杰 张玉蓉

(郑州澍青医学高等专科学校临床医学系内儿教研室,郑州 450064)

胎粪吸入综合征(Meconium aspiration syndrome，MAS)是一种严重的新生儿呼吸衰竭，由胎儿宫内气喘或前几次呼吸期间吸入胎粪引起的[1]。胎粪是新生儿的第一次大便，由羊水、黏液、胆汁、胎毛和皮肤及消化道细胞组成[2]。由胎粪引起的肺损伤是复杂的，可归因于气道的机械系阻塞、表面活性剂失活、化学性肺炎和肺动脉高压[3]。根据吸入胎粪的时间和数量，胎粪可能导致部分或完全气道阻塞，导致肺泡过度充气或肺不张。被困气体可能会引发肺泡破裂，导致空气泄露综合征，如肺间质性肺水肿、气胸和肺炎支原体。尽管产科和新生儿护理有所改善，但其发病率和死亡率都很高，迫切需要更安全有效的治疗选择。蒲公英是一种菊科多年生草本植物，现代药理研究表明蒲公英具有利胆、利尿、抗氧化、消炎和抗癌特性[4]。蒲公英的所有部分都可以用药，尤其是富含多糖的根部，被广泛用于临床治疗各种感染性和炎性疾病，如支气管炎、肺炎、上呼吸道感染、肝炎等[5]。蒲公英提取物(Dandelion extract)是从传统中药蒲公英(Taraxacum mongolicum Hand.-Mazz.)中提取而成，具有多种药理作用。已有研究表明蒲公英提取物对脂多糖诱导的小鼠急性肺损伤具有保护作用[6]。本文旨在研究蒲公英提取物对胎粪诱导的吸入性肺损伤的保护作用。

1 材料与方法

1.1材料 蒲公英全草(FCSPZYD7585)购自北京同仁堂；地塞米松(SD953F0)购自北京索莱宝科技有限公司;苏木素-伊红染液(D006-1-1)、Masson染液(D026-1-3)、髓过氧化物酶测试盒(A044-1-1)、丙二醛测定试剂盒(A003-1-2)购自南京建成生物工程研究所;Anti-TNF-α(ab6671)、IL-6 ELISA Kit(ab100712)、IL-1β、IL-8(ab7747)和MCP-1(ab9669)ELISA Kit(ab100704)购自美国Abcam公司。

1.2方法

1.2.1蒲公英提取物制备[7]100 g蒲公英全草用纱布包裹，室温下用水浸泡0.5 h，100℃加水提取3次：2 000 ml提取3 h，1 500 ml提取2 h，1 000 ml提取1 h。将3次提取液混合浓缩至100 ml，用0.22 μm注射器过滤器过滤并冻干，得到淡黄色粉末。

1.2.2动物模型的建立[8]及分组 40只SD大鼠购自常州卡文斯实验动物有限公司，雄性，1日龄。将大鼠用异氟烷(100 mg/kg)麻醉，置于手术台，仰卧位，气管切开后插入气管导管，采用随机数字表法将大鼠分为四组：空白对照组(Control)、模型组(Model)、地塞米松组(DEX)和蒲公英提取物组(Dandelion)。空白对照组通过导管缓慢注入生理盐水(1.5 ml/kg)，其余3组大鼠均注入胎粪(1.5 ml/kg)，所有大鼠呼吸机机械通气30 min，确保生理盐水均匀进入支气管及肺泡，缝合切口。地塞米松组静脉注射地塞米松(0.5 mg/kg)，蒲公英提取物组静脉注射蒲公英提取物(10.0 mg/kg)，空白对照组及模型组注射等量生理盐水。12 h后所有大鼠放血至死，10%福尔马林固定肺组织并进行石蜡包埋。

1.2.3肺湿干重比值 取各组大鼠左肺叶称取湿重(W)，置于80℃烤箱烘烤24 h，称量干重(D)，计算湿干重比值(W/D)。

1.2.4动脉血气分析 分别于建立模型前1 h，建立模型后1、3、6、12 h采集大鼠动脉血，用血气分析仪测定PaO2。

1.2.5HE染色 采用苏木素-伊红(H-E)染液，将石蜡切片脱蜡，蒸馏水润湿组织，核染液染色5 min，水洗5 s，浆染液染色30 s，水洗后，滤纸吸干，无水乙醇脱水2次后封片，在荧光显微镜下观测。

1.2.6Masson染色 用蒸馏水润湿玻片60 s，将组织用核染液染色60 s，弃去核染色液后用冲洗液冲洗30 s，浆染液染色60 s，弃去浆染液，冲洗液冲洗30 s，黄色分色液分色8 min，弃去分色液后直接用蓝色复染液染色5 min，弃去蓝色复染液，用无水乙醇冲洗干净，吹干，无毒环保封固剂封片。在荧光显微镜下观测。

1.2.7ELISA 在4℃下用50 mmol/L的碳酸盐包被缓冲液溶解抗原，100 μl/孔加到96 孔酶标板，将抗原包被过夜，弃去包被液，用PBST洗涤3次，每次5 min，每孔加150 μl 1%BSA封闭1 h，PBST洗涤3次，加入100 μl不同倍比稀释度的血清，并加入对照样品，37℃孵育2 h，PBST洗涤5次，加入100 μl稀释后的HRP标记的二抗，37℃孵育1 h，PBST洗涤5次后显色剂显色20 min，用酶标仪测定。

1.2.8MPO、MDA 根据试剂盒说明书，用可见分光光度计测定大鼠血清中髓过氧化物酶(MPO)，肺组织髓过氧化物酶(MPO)和丙二醛(MDA)活力,1 cm 光径，蒸馏水调零，在460 nm处测MPO吸光度值，在532 nm处测MDA吸光度值。

2 结果

2.1蒲公英提取物减轻病理损伤 HE染色结果如图1所示。Control组肺泡壁完好无增厚、无炎性浸润、无充血。Model组大鼠肺组织表现明显病理损伤、肺泡壁结构不完整、出血、水肿严重、炎症细胞浸润、肺组织实化。DEX组可见明显肺泡壁增厚、轻度出血、水肿、广泛炎症细胞浸润。Dandelion组肺泡壁轻微增厚、中度出血、水肿弥散性炎症细胞浸润;Masson染色显示Control组大鼠肺组织未发生明显纤维化。Model组大鼠肺组织大量区域被染为蓝色，呈现高纤维化。DEX组大鼠肺组织部分区域被染为蓝色。Dandelion组少量区域被染为蓝色，纤维化程度低。

2.2蒲公英提取物下调PaO2水平 检测大鼠动脉血氧分压，结果如图2所示：Model组PaO2水平12 h内呈下降趋势极显著低于Control组(P<0.01)，DEX、Dandelion组PaO2水平极显著高于Model组(P<0.01)。

2.3蒲公英提取物降低W/D比值 检测各组大鼠肺湿干重比值(W/D)，如图3所示：Control组W/D值显著低于Model组(P<0.05)，DEX、Dandelion组W/D值显著低于Model组(P<0.05)。

2.4血清炎症因子水平 检测血清中TNF-α、IL-6、IL-1β、IL-8和MCP-1水平，如表1所示：与Control组相比较，Model组血清中TNF-α、IL-6、IL-1β、IL-8和MCP-1水平显著升高(P<0.01)，DEX、Dandelion组血清中TNF-α、IL-6、IL-1β、IL-8和MCP-1水平显著低于Model组。

2.5肺泡灌洗液中炎症因子水平 检测肺泡灌洗液中TNF-α、IL-6、IL-1β、IL-8、MCP-1水平，结果如表2所示：与Control组相比较，Model组TNF-α、IL-6、IL-1β、IL-8、MCP-1水平显著升高(P<0.01)，Model组TNF-α、IL-6、IL-1β、IL-8、MCP-1水平极显著高于DEX组(P<0.01)，Dandelion组TNF-α、IL-6、IL-1β、IL-8、MCP-1水平极显著高于DEX组(P<0.01)。

2.6蒲公英提取物抑制MPO、MDA活力 检测血清中MPO和肺MPO、MDA活力，如表3所示：Model组血清中MPO活力极显著高于Control组(P<0.01)，DEX、Dandelion组血清中MPO活力极显著低于Model组(P<0.01)；Model组肺MPO活力极显著高于Control组(P<0.01)，DEX、Dandelion组肺MPO活力极显著低于Model组(P<0.01)；Model组肺MDA活力极显著高于Control组(P<0.01)，DEX、Dandelion组肺MDA活力极显著低于Model组(P<0.01)。

图1 肺组织病理损伤情况Fig.1 Pathological injury of lung tissue

图2 动脉血气分析Fig.2 Arterial blood gas analysisNote:*.P<0.05 vs control group；##.P<0.01 vs model group.

图3 肺湿干重比值Fig.3 Ratio of wet to dry lung weightNote:*.P<0.05 vs control group;#.P<0.05 vs model group.

表1 血清炎症因子水平

Tab.1 Serum levels of inflammatory cytokines

GroupsSerum TNF-α(pg/ml)Serum IL-6(pg/ml)Serum IL-1β(pg/ml)Serum IL-8(pg/ml)Serum MCP-1(pg/ml)Control47.14±5.34 29.10±2.5147.15±4.25 98.08±5.2387.63±9.36 Model159.31±20.461)98.05±9.351)136.64±14.471)168.19±8.361)267.59±16.781)DEX55.61±4.542)36.32±3.862)63.84±5.532)118.84±4.372)129.71±11.252)Dandelion73.98±6.392)48.76±5.062)79.34±8.102)125.58±8.432)142.36±9.252)

Note：1)P<0.01 vs control group;2)P<0.01 vs model group.

表2 BALF中炎症因子水平

Tab.2 Levels of inflammatory cytokines in BALF

GroupsBALF TNF-α(pg/ml)BALF IL-6(pg/ml)BALF IL-1β(pg/ml)BALF IL-8(pg/ml)BALF MCP-1(pg/ml)Control27.36±6.98346.27±6.3136.29±3.8128.29±5.7449.38±7.31Model62.93±3.641)436.33±4.321)66.52±4.361)45.82±6.631)75.86±5.561)DEX43.26±2.622)360.52±3.812)42.33±5.642)32.41±5.192)65.76±6.632)Dandelion47.17±4.152)378.24±6.562)52.91±2.912)34.92±6.852)67.86±6.972)

Note：1)P<0.01 vs control group;2)P<0.01 vs model group.

表3 检测MPO,MDA活力

Tab.3 Detected MPO and MDA activity

GroupsSerumMPO(U/L)Lung MPO(U/g prot)Lung MDA(nmol/mg prot)Control141.35±18.340.53±0.060.89±0.12Model245.06±12.361)0.93±0.101)2.08±0.451)DEX123.66±13.402)0.61±0.062)0.91±0.092)Dandelion143.98±16.392)0.76±0.062)1.52±0.182)

Note：1)P<0.01 vs control group;2)P<0.01 vs model group.

3 讨论

胎粪吸入综合征是新生儿肺损伤和呼吸衰竭的主要原因，发病率约为0.5%，死亡率在发展中国家居高不下[9]。胎粪可以趋化嗜中性粒细胞、单核细胞和巨噬细胞，并通过肺微血管膜触发其泄漏[10]。目前胎粪吸入综合征的常规治疗包括产时和产后口腔抽吸，然而这些技术并没有降低胎粪吸入综合征的发病率，在治疗胎粪吸入综合征的药物，如抗生素、消炎药、血管扩张剂等，只有吸入一氧化氮和表面活性剂才能减少胎粪吸入综合征患儿体外膜肺氧合的需要[11]。因此，基于对胎粪吸入综合征病理生理学的更好理解，发现疗效好无副作用的药物是重要的。

蒲公英是一种分布于世界各地的食用植物，属于菊科，被认为是最耐受的药用植物之一，几乎没有记录的副作用。由于蒲公英含有植物性胆固醇，具有利尿和抗炎特性，长期以来一直在临床上使用[12]。已有研究证明蒲公英提取物显示出针对肺损伤的有利治疗作用。Ma等[13]研究发现蒲公英水提取物通过抑制PI3K/Akt/mTOR信号通路对脂多糖诱导的急性肺损伤炎症产生抗炎作用。Liu等[6]研究发现蒲公英提取物通过降低脂多糖诱导的肺MPO活性，增加SOD活性，减轻肺组织损伤。本文研究发现，蒲公英提取物具有升高胎粪诱导的吸入性肺损伤大鼠PaO2的水平，减轻肺组织病理损伤程度的作用。

水肿不仅是全身炎症的典型症状，也是局部炎症的典型症状，为了量化肺水肿的程度，我们评估了肺的W/D比值。在此，我们发现蒲公英提取物能降低肺的W/D比值，说明蒲公英提取物能抑制浆液向肺组织渗漏，减轻肺水肿的发生。

胎粪诱导的肺部炎症在胎粪吸入综合征的发病机制中起着重要作用，蒲公英长期用于治疗包括炎症在内的人类疾病，这种抗炎作用可能是通过减少一氧化氮、前列腺素、TNF-α、IL-1β、IL-6和环氧合酶(COX)-2对巨噬细胞的作用产生的[14]。胎粪在肺内发生炎症反应，引发肺毛细血管炎性渗出，炎性细胞参与其中并释放相关炎性介质，从而对细胞造成损伤，导致肺损伤[15]。Berdeli等[16]研究发现胎粪通过大鼠肺泡巨噬细胞增加IL-6和TNF-α的产生。Han等[17]研究发现蒲公英提取物通过降低TNF-α、IL-6、IL-1β的表达可预防结肠炎。本文研究发现，蒲公英提取物具有降低血清和肺泡灌洗液中TNF-α、IL-6、IL-1β、IL-8和MCP-1表达的作用，从而降低肺部炎症。说明蒲公英提取物通过调节炎症因子改善大鼠吸入性肺损伤。

MPO是中性粒细胞的嗜天青颗粒所释放的过氧化物酶，MPO活性反映了肺中性粒细胞的附着和边缘化[18]。中性粒细胞在细胞外培养基中排泄MPO，导致HOCI和其他几种活性氧衍生物的积累，并导致蛋白质或细胞结构的氧化修饰[19]。MDA是脂质过氧化反应的最终产物，并在一定程度上显示出了氧化应激的水平[20]。Lu等[21]研究发现蒲公英提取物通过降低肺MPO、MDA活性减轻胎粪诱导的吸入性肺损伤。Li等[22]研究发现蒲公英提取物可通过降低MDA活性抑制三阴性乳腺癌细胞凋亡。本文研究发现，吸入性肺损伤新生大鼠肺MDA活力升高，表明吸入胎粪破坏肺组织细胞膜结构，而加入蒲公英提取物后，MDA活力降低，表明蒲公英提取物具有抗氧化作用，且蒲公英提取物极显著降低大鼠血清MPO及肺MPO活性，表明蒲公英提取物可以抑制胎粪诱导的吸入性肺损伤发展过程中中性粒细胞的作用和浸润。

总的来说，本研究揭示了蒲公英提取物对吸入性肺损伤新生大鼠的保护作用：减轻肺组织病理损伤程度，升高PaO2水平，降低肺的W/D比值，降低血清和肺泡灌洗液中炎症因子TNF-α、IL-6、IL-1β、IL-8和MCP-1的表达，降低大鼠血清MPO活性及肺MPO、MDA活性。本研究结果阐明了蒲公英提取物具有治疗胎粪吸入综合征的潜力，下一步计划针对蒲公英提取物改善胎粪吸入综合征的作用机制及合适的给药方案与是否存在不良反应作进一步研究。