刘昱麟 马贤德 宋采秋 徐 畅 张双双 王 哲

(辽宁中医药大学，沈阳 110847)

中风是近年来在老年人群中发病率较高的一种疾病，并且患者发病后往往伴随着终身残疾，这给患者和患者家庭带来了严重的心理创伤和经济负担。据统计，每年因患中风而死亡的人数约600万人，预计到2030年，中风患病人数将增加20%，花费也将达到2010年的2倍以上，因此中风的防治方法将是未来几年的人类社会一大难题[1，2]。西医的经典溶栓方案受到多种条件的限制，只有少数患者能符合条件，唯一被FDA批准治疗急性缺血性脑卒中的药物仅有重组组织型纤溶酶原激活剂(recombinant tissue type plasminogen activator，rt-PA)。更值得注意的是，抗缺血性脑卒中药物的研发也屡屡受挫。眼针疗法为彭静山教授根据“五轮八廓”，“全身精气上注于目”及经脉循行等理论为指导核心，所创立的一种微针疗法。中医认为，肾精亏耗，水不涵木，肝阳偏亢，内风遂即而生，而眼针针刺肝区、肾区、上下焦区等能平肝潜阳，滋补肾精，平衡阴阳。而眼针在40余年缺血性中风疾病的治疗中也取得了显著疗效，因此我们认为，眼针疗法可能成为缺血性中风新的防治手段。

研究表明，当脑缺血发生时，细胞间信号传递迅速发生变化，机体可以在数小时内启动炎症模式，随着大脑细胞内外炎症相关因子过度表达，炎症反应也随之产生。炎症反应是组织器官缺血再灌注后最重要的病理生理过程，在脑缺血再灌注损伤的病理机制中占据重要地位。而报道显示，炎症信号的大量激活可以诱导细胞焦亡关键蛋白P2X7R、NLRP3、pro-caspase-1、ASC的产生，诱发炎症小体形成，刺激caspase-1激活，使细胞向外分泌IL-1β、IL-18从而诱导细胞焦亡，同时扩大炎症反应，加重脑缺血再灌注损伤[3,4]。研究表明，格列本脲是NLRP3的抑制剂，能阻断NLRP3的表达，抑制炎症小体形成的关键环节[5]，且格列本脲可以改善缺血性脑中风导致的神经细胞数目降低[6]，保护脑缺血时脑损伤的发生[7]。因此探明在脑缺血再灌注发生时，眼针疗法对焦亡过程是否有调控作用有极为重要的意义。

1 材料与方法

1.1材料

1.1.1实验动物 本实验采用雄性SPF级Sprague-Dawley(SD)大鼠85只，体重(280±20)g，购自辽宁长生生物有限公司。实验中心许可证编号：SCXK(辽)2015-0001。通过动物实验伦理审查后(辽宁中医药大学动物伦理审查编号：21000092017048)开始饲养。使用大鼠生长、繁殖用标准颗粒饲料喂养；喂养期间自由饮水，室内温度(22±2)℃，相对湿度45%。适应性喂养2周后，进行实验。

1.1.2实验试剂 Anti-P2X7 antibody(货号ab48871)，Anti-NLRP3 antibody(货号ab214185)，Anti-pro Caspase-1 antibody(货号ab179515)，Anti-TMS1/ASCantibody(货号ab175449)，Anti-Caspase-1 antibody(货号ab1872)，大鼠IL-1 beta ELISA试剂盒(货号ab100768)和大鼠IL-18 ELISA试剂盒(货号ab213909)购自abcam公司。HRP标记的羊抗兔二抗购自北京中杉金桥生物科技有限公司。蛋白提取试剂和蛋白定量试剂盒购自碧云天生物技术研究所。

1.2方法

1.2.1分组方法 将85只SD大鼠，按照随机数表法，分为假手术组(16只)和造模组(69只)，将造模成功的大鼠再次随机均分为：模型对照组、眼针组、抑制剂组。

1.2.2模型复制 采用线栓法复制CIRI大鼠模型，方法参考马贤德等[8]的研究方法。方法如下：采用10%水合氯醛，按照大鼠体重，0.3 ml/100 g给药；大鼠麻醉仰卧于手术台上固定，颈部备皮，在大鼠气管旁开0.5 cm出剪开一条3 cm左右的切口，分离颈部肌肉，使颈总动脉、颈外动脉、颈内动脉充分暴露，动脉夹夹闭颈总动脉近心端后，电凝颈外动脉并剪断，在颈外动脉游离端剪一“V”字口，使用带有标记的鱼线(2.5号；直径0.28 mm；鱼线头部打磨，分别于0.6 cm处、1.8 cm 和2.2 cm 处做标记，以便判断栓塞位置)从“V”字口插入颈内动脉，感受到阻力后检查鱼线标记，到达标记后即为栓塞正确。

假手术组大鼠采用上述相同的术式进行手术，但鱼线栓塞深度仅为1 cm。

1.2.3模型评价

1.2.3.1行为体征评分 参照Longa 5分制评分标准[9]:0分为无症状；1分表现为对侧前爪不能完全伸展；2分表现为肢体旋转；3分表现为肢体不协调向对侧倾倒；4分表现为不能自主行走，无意识。大鼠模型成功的标准：缺血2 h后对大鼠进行再灌注，再灌注后评价神经功能缺损程度，将评分为1～3分者纳入实验组，未达标准者排除。正常组未做处理。

1.2.3.2脑组织TTC染色 大鼠完成神经功能缺损评分后过量麻醉后处死，取完整脑组织，-20冷冻30 min，从冰箱取出后均匀切成1.5 mm切片，水平放置于培养皿，加入2%TTC染液，于温箱中37℃孵育40 min，中间翻转组织切片一次。完成后拍照保存。

1.2.4干预措施 假手术组：大鼠不作处理，正常饲养至实验结束。模型对照组：大鼠不作处理，正常饲养至再灌注24 h后。眼针组：①干预时间：再灌注完成后即刻及再灌注8、16、24 h共计进行4次干预。②干预材料：0.18×13毫针。③干预方法：选取眼针针刺穴区中的肝胆区、肾膀胱区、上焦区、下焦区进行干预。采用自制的大鼠眼针定位器进行眼周穴区定位，确定大鼠眼眶后，在眶内0.2 cm进行针刺。抑制剂组：大鼠一次性经腹腔注射格列本脲，500 mg/kg。

1.2.5样本采集 末次针刺后，大鼠麻醉后经腹主动脉取血5 ml，静置1 h后，离心保留血清。大鼠取血后采用过量麻醉法处死，各组大鼠中随机抽取6例全脑，浸泡于4%多聚甲醛溶液中固定，5例取电镜组织浸泡于固定液中，剩余各组大鼠，冰面上分离海马及缺血区周边半暗带脑组织，冻存于-80℃冰箱中以便后期使用免疫组织化学法、Western blot法检测脑组织中P2X7R、NLRP3、pro-caspase-1、ASC、caspase-1的表达水平；ELISA法检测脑缺血半暗带组织中IL-1β、IL-18的含量；同时检测脑组织中IL-1β、IL-18含量。

1.2.6指标检测

1.2.6.1ELISA法检测脑缺血半暗带组织中IL-1β、IL-18的含量 ELISA法检测各组大鼠脑组织中IL-1β、IL-18表达：将试剂盒中的标准品和各组收集到的组织所提取出的蛋白依次加入96孔板中(每孔100 μl)，在空白孔加入100 μl PBS。参照IL-1β、IL-18试剂盒说明书操作，于450 nm波长测定各孔的吸光光度值，通过标准曲线计算出IL-1β、IL-18的浓度。

1.2.6.2电镜检测焦亡小体 将固定4 h后的组织从缓冲液拿出后,经乙醇、丙酮脱水,采用常规电镜包埋技术,再将包埋后的组织切成60 nm厚的超薄切片。用柠檬酸铅及醋酸铀将切片充分染色后,在透射电镜下，每组选取5个随机视野，观察焦亡小体的形态并拍摄记录。

1.2.6.3免疫组织化学法检测脑组织中P2X7R、NLRP3、pro-caspase-1、ASC、caspase-1的表达 采用免疫组织化学法检测脑组织中P2X7R、NLRP3、pro-caspase-1、ASC、caspase-1的表达位置及相对水平。将多聚甲醛中固定的脑组织取出，充分冲洗组织表面残余的多聚甲醛溶液，制备常规石蜡切片，脱蜡至水后采用抗原热力修复法使抗原间闭合的醛基打开，去除内源性过氧化物酶后用5% BSA封闭。加入一抗(1∶400) 4℃孵育过夜，从冰箱拿出后复温 1 h 后加入二抗(1∶2 000)室温摇床孵育2 h，洗片后滴加DAB显色液，适度时间终止显色，滴加苏木素复染细胞核，随后1%盐酸酒精分化，封片。数码显微镜下观察染色情况，测定5个随机视野中的平均光密度值，以5个随机视野所测得的平均值作为该例样本中目的蛋白的相对表达水平，随后进行统计分析。

1.2.6.4Western blot法检测海马组织中P2X7R、NLRP3、pro-caspase-1、ASC、caspase-1的表达 采用Western blot法检测海马组织中P2X7R、NLRP3、pro-caspase-1、ASC、caspase-1的表达水平的表达水平。将-80℃冷冻的海马组织取出，加入WB及IP细胞裂解液(组织：细胞裂解液=100 mg：1 ml)，使用电动匀浆机对脑组织进行匀浆后提取总蛋白。采用BCA法测定总蛋白浓度，加入上样缓冲液(×5)沸水浴5 min使蛋白变性。以每孔50 μg的上样量进行上样，电泳结束后湿转法转印至PVDF膜上，经5% BSA封闭后，加入一抗(浓度1∶500)于冰箱(4℃)孵育过夜，二抗(1∶2 000)室温摇床孵育2 h，洗膜后，将PVDF膜放入凝胶成像分析系统中，并滴加ECL工作液，曝光后采集图像，使用灰度值分析软件测定目的蛋白及内参蛋白条带的灰度值，以目的蛋白/内参蛋白灰度值的比值作为该样本中目的蛋白相对表达水平，进行统计分析。

1.3统计学方法 采用Graphpad Prism 6统计软件进行统计分析并绘制统计图表,计量资料服从正态分布时,采用单因素方差分析(One-way ANOVA),组间比较采用t检验。P<0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1模型评价

2.1.1行为体征评分 模型复制后，由于手术过程中发生意外，死亡3只，3只大鼠行为体征评分为零，予以剔除；因此造模结束后假手术组共计16只，造模组共计63只。与假手术组比较，造模组大鼠的神经功能评分显著增高，且P<0.05，差异有统计学意义，见图1。

2.1.2TTC染色结果 造模结束后，从假手术组和造模组中随机抽取1例进行TTC染色，染色结果如图2所示：假手术组脑组织未见异常；造模组右侧脑组织局部出现白色区(白色区即为缺血缺氧区)。

2.2各组大鼠一般状态

2.2.1基本情况 造模成功后将TTC染色后剩余62只大鼠，按照随机数表法分成眼针组21只，抑制剂组20只，模型对照组21只。假手术组15只大鼠，饮食运动如常，伤口愈合良好，毛色光亮，精神佳。模型对照组大鼠，精神萎靡，姿态呈蜷缩睡眠状，轻拍笼底有缓慢移动，抑制剂组、眼针组大鼠，饮食尚可，运动欠灵活，精神欠佳，但精神状态与活动度已明显优于模型对照组大鼠。

2.2.2行为体征评分 治疗结束后，由于治疗过程中发生意外及大鼠自身抵抗力等不可控力，模型对照组大鼠死亡6只、眼针组大鼠死亡4只、抑制剂组大鼠死亡4只，予以剔除；因此治疗结束后，假手术组共计15只，模型对照组共计15只，眼针组共计17只，抑制剂组共计16只。与假手术组比较，模型对照组、眼针组、抑制剂组大鼠行为体征评分明显升高(P<0.01)，差异有统计学意义；与模型对照组比较，眼针组、抑制剂组大鼠行为体征评分明显降低(P<0.01)，差异有统计学意义。与眼针组比较，抑制剂组大鼠行为体征评分明显改变(P>0.05),差异无统计学意义。见图3。

2.3ELISA法检测脑组织及脑缺血半暗带组织中IL-1β、IL-18的含量 各组大鼠ELISA法检测显示：与假手术组比较，模型对照组、眼针组、抑制剂组大鼠IL-1β、IL-18的表达含量明显升高(P<0.01)，有统计学意义。 与模型对照组比较，眼针组、抑制剂组大鼠IL-1β、IL-18的表达含量明显降低(P<0.01)，有统计学意义。与眼针组比较，抑制剂组大鼠IL-1β、IL-18的表达含量无明显变化(P>0.05)，无统计学意义，见图4。

图1 造模后各组间行为体征评分差异Fig.1 Differences in behavioral sign scores between groupsafter modelingNote:*.P<0.05.

图2 TTC染色结果Fig.2 TTC staining results

2.4电镜观察脑组织神经元细胞中细胞焦亡的发生 假手术组：细胞膜完整，通透性未见异常； 细胞器，细胞核等未见异常；模型对照组：细胞肿胀，细胞膜稳定性下降，失去完整性，可见细胞膜穿孔，细胞器破坏，内容物释放 ；眼针组、抑制剂组：细胞膜通透性稍有增高，内容物完整,偶见细胞器损坏，见图5。

图3 治疗后各组大鼠行为体征评分差异柱状图Fig.3 Differences in behavioral signs scores between groups after treatmentNote:Compared with the Sham-operated group,**.P<0.01;compared with the model group，##.P<0.01.

图4 各组大鼠脑组织中相关蛋白的表达(ELISA)Fig.4 Expression of related proteins in brain tissue of rats in each group(ELISA)Note:Compared with the Sham-operated group,**.P<0.01;compared with the model group,##.P<0.01.

图5 透射电镜扫描结果(×7 000)Fig.5 TEM scan results(×7 000)

2.5免疫组织化学法检测脑组织中P2X7R、NLRP3、pro-caspase-1、ASC、caspase-1的表达 各组大鼠免疫组织化学检测显示：与假手术组比较，模型对照组大鼠脑组织中P2X7R、NLRP3、pro-caspase-1、ASC、caspase-1表达水平显著增强，差异有统计学意义(P<0.01)。与模型对照组比较，眼针组P2X7R、NLRP3、pro-caspase-1、ASC、caspase-1表达水平显著降低，差异有统计学意义(P<0.01)；抑制剂组大鼠脑组织中NLRP3、pro-caspase-1、ASC、caspase-1表达水平显著降低,差异有统计学意义(P<0.01)。与眼针组比较，抑制剂组大鼠脑组织中NLRP3、pro-caspase-1、ASC、caspase-1表达水平无明显变化,差异无统计学意义(P>0.05),P2X7R表达水平明显增高，差异有统计学意义(P<0.01)，见图6。

图6 各组大鼠脑组织中相关蛋白的表达(IHC)Fig.6 Expression of related proteins in brain tissue of rats in each group(IHC)Note:Compared with the Sham-operated group,**.P<0.01;compared with the model group,##.P<0.01；compared with the eye-acupuncture group,△△.P<0.01.

图7 各组大鼠脑组织中相关蛋白的表达(Western blot)Fig.7 Expression of related proteins in brain tissue of rats in each group(Western blot)Note:Compared with the Sham-operated group，**.P<0.01;compared with the model group,##.P<0.01；compared with the eye-acupuncture group,△△.P<0.01.

2.6Western blot法检测海马组织中P2X7R、NLRP3、pro-caspase-1、ASC、caspase-1的表达 各组大鼠Western blot结果显示：与假手术组比较，模型对照组大鼠脑组织中P2X7R、NLRP3、pro-caspase-1、ASC、caspase-1表达水平显著增强，差异有统计学意义(P<0.01)。与模型对照组比较，眼针组P2X7R、NLRP3、pro-caspase-1、ASC、caspase-1表达水平显著降低，差异有统计学意义(P<0.01)；抑制剂组大鼠脑组织中NLRP3、pro-caspase-1、ASC、caspase-1表达水平显著降低,差异有统计学意义(P<0.01)，P2X7R表达含量无明显变化，差异无统计学意义(P>0.05)。与眼针组比较，抑制剂组大鼠脑组织中NLRP3、pro-caspase-1、ASC、caspase-1表达水平无明显变化,差异无统计学意义(P>0.05),P2X7R表达水平明显增高，差异有统计学意义(P<0.01)，见图7。

3 讨论

中风为全球第二大死因及高负担疾病，仅2013年，全世界就有640万人死于中风。而在中国，中风为首要致死疾病。根据2017NESS-China的一项研究显示，中国人口脑卒中的患病率约为1 114.8/10万人[10]。中风按照国际疾病分类原则(ICD)分为3大类，即缺血性脑卒中(Ischemic stroke，IS)、出血性脑卒中(Hemorrhagic stroke，HS)和病理类型未明确型脑卒中(Stroke of undetermined pathological type，UND)，而缺血性脑卒中占中风患者的69.6%～70.8%[11]，因此，缺血性脑卒中是一项亟待解决的医学难题。

关于中风疾病的防治手段，西医往往采用溶栓疗治，中医通常运用平肝熄风醒脑开窍之法。眼针疗法是由彭静山教授根据《证治准绳》《审视瑶函》首创的一种针刺针法[12]，目前该疗法已被广泛应用于临床三百多种疾病的治疗，以疗效显著，患者痛苦轻，经济负担小的优势吸引着来自于世界各地的患者。研究结果显示：与假手术组比较，模型对照组大鼠基本状态欠佳，行为功能评分增高，这也与临床脑卒中患者的一般状态一致，因此我们的研究结果也将对临床有重要的指导意义。

前期，我们通过973课题，国家自然基金和多项省市级课题研究发现，眼针具有抗炎、抗氧化、抗凋亡等作用[13-16]，而炎症反应作为脑卒中疾病发生的关键的环节，在脑缺血机制研究中有着十分重要的价值。实验结果显示：与假手术组比较，模型对照组大鼠IL-1β、IL-18表达明显升高，差异有统计学意义(P<0.01)；与模型对照组比较，眼针组与抑制剂组大鼠IL-1β、IL-18表达明显降低，差异有统计学意义(P<0.01)；与眼针组比较，抑制剂组大鼠IL-1β、IL-18表达无明显改变(P>0.05)，差异无统计学意义。这表明，在脑卒中发生的过程中，存在炎症反应表达增强，虽然眼针与抑制剂组的IL-1β、IL-18表达无明显差异，但是两者趋势一致，因此眼针和抑制剂都能有效抑制炎症的发生，从而减轻炎症带来的脑部损伤。

细胞焦亡是兼具凋亡和坏死的一种细胞死亡过程，其特点是细胞的裂解-包括细胞膜孔隙的形成，细胞肿胀坏死，大量细胞内容物的释放等[17]。焦亡的发生是以炎症小体形成为主要基础的炎症级联反应[18]。P2X7受体(purinergic 2X7 receptor)是一种ATP门控的跨膜离子通道受体，是炎症小体激活的关键因子，研究表明，细胞外ATP可以通过激活P2X7受体调控K+外流，诱导NLRP3(NLR family,pyrin domain-containing 3)的活化[19]。NLRP3是炎症因子的重要组成部分[20-22]，目前研究表明，炎性小体是机体收到感染或细胞损伤信号后组装的蛋白复合物，是募集和激活pro-caspase-1的平台。启动蛋白NLRP3可以通过寡聚作用来利用炎性小体适配器分子ASC(apoptosis-associated speck-like protein containing a CARD)招募大量的procaspase-1[23]。procaspase-1是caspase-1的前体，活跃的caspase-1负责快速裂解细胞激活并向细胞外释放IL-1β及IL-18等，进一步加剧炎症反应，这种由炎症小体参与的细胞死亡方式称为焦亡[24,25]。实验结果显示，CIRI大鼠脑组织中发生了细胞焦亡。与假手术组比较，模型对照组大鼠P2X7R、NLRP3、pro-caspase-1、ASC、caspase-1的表达明显升高，差异有统计学意义(P<0.01)。这也与以往的报道一致。与模型对照组比较，眼针组P2X7R、NLRP3、pro-caspase-1、ASC、caspase-1表达水平显著降低，差异有统计学意义(P<0.01)；抑制剂组大鼠脑组织中NLRP3、pro-caspase-1、ASC、caspase-1表达水平显著降低,差异有统计学意义(P<0.01)，P2X7R表达含量无明显变化，差异无统计学意义(P>0.05)。这表明眼针能够抑制P2X7R、NLRP3、pro-caspase-1、ASC、caspase-1的表达，进而调控细胞焦亡的发生，减缓患者脑部炎症小体聚集，降低炎症因子的表达而发挥抗炎作用。与眼针组比较，抑制剂组大鼠NLRP3、pro-caspase-1、ASC、caspase-1、无明显改变(P>0.05)，差异无统计学意义，P2X7R表达水平明显增高，差异有统计学意义(P<0.01)。结果表明，NLRP3的抑制剂可以抑制细胞焦亡关键蛋白NLRP3与NLRP3相关的焦亡下游蛋白，而对P2X7R没有调节作用，而眼针却对焦亡进程中的关键蛋白P2X7R、NLRP3、pro-caspase-1、ASC、caspase-1都有调控作用。

综上所述，眼针可以通过抑制细胞焦亡的发生，多靶点调控脑卒中疾病，因此眼针可能将成为脑卒中疾病的新的治疗方案。