叶静 马长宏

硫酸多糖类药物主要包括岩藻聚糖硫酸酯、肝素、甘糖酯以及硫酸软骨素等等。目前也有较多研究［1,2］证实硫酸多糖具有调节免疫、抗凝血以及抗病毒等多种生物活性。同时张璐欣等［2］指出,生物活性和硫酸化程度有着密切的关系。而多糖作为一种药物,它的含量高低会给药效带来直接影响。加之多糖药物结构存在不均一性,因此不同的药物含量测定方法,其测定含量的结果也不一样［3］。本文主要针对目前国内外的硫酸多糖类药物结构组成、来源以及相关含量的测定方法进行针对性的分析总结,概述硫酸多糖类药物含量测定方法近几年的发展趋势,以望为后期硫酸多糖类药物含量测定带来一定的参考依据。现报告如下。

1 硫酸多糖类药物的来源

1.1肝素 猪的肠黏膜或是牛的肠黏膜是肝素的主要来源,肝素属于天然黏多糖之一,由70%～90%的2-硫酸艾杜糖醛酸以及N-硫酸-6-硫酸-氨基葡萄糖,加上10%～30%的N-硫酸氨基葡萄糖以及10%～20%的葡萄糖醛酸、艾杜糖醛酸组成［3］。

1.2硫酸软骨素 猪气管以及猪喉骨等软组织是硫酸软骨素的主要来源,其为天然黏多糖之一,是由D-葡萄糖醛酸以及N-乙酰半乳糖胺组成的共聚物［4］,目前常见的天然的硫酸软骨素有硫酸软骨素A、B、C等。

1.3甘糖酯 甘糖酯是以藻酸双酯钠合成作为基础,将褐藻胶进行一系列的降解以及分级纯化后所得的产物PM当作原料,之后再通过化学合成的方法获得半合成硫酸多糖。

1.4岩藻聚糖硫酸酯 岩藻聚糖硫酸酯的来源主要通过提取海带中的水溶性杂多糖,它是肾海康中常见的一种主要成分,而肾海康是目前临床上治疗慢性肾衰竭中常见的一种海洋药物［4］。

2 硫酸多糖类药物含量测定方法

2.1直接染色法 直接染色法是目前常见的硫酸多糖类药物含量测定方法之一,由于硫酸多糖类药物中的羧基以及硫酸基都带有负荷,因此能够和带有正电荷的阳离子染料结合,致使吸光度发生一定程度的变化,根据其变化能够测定其含量［5］。直接染色法目前常见的有结晶紫染色法、二甲美兰染色法以及维多利亚蓝B染色法等。但是需要注意的是,由于阳离子染料种类以及乳化剂的种类都比较多,而不同种类的反应条件也不同,因此在进行测定的时候,还需要根据实际需要来选择适合的阳离子染料以及乳化剂。

2.2酸降解-显色法 酸降解-显色法也是常用的测定方法之一,该测定方法将多糖聚合物的结构作为途径入手,在酸性条件的环境下,将多糖聚合物转化为寡糖单元或者是转化为单糖以便进行测定。其中单糖、寡糖以及糖醛酸等是当下常见的多糖聚合物结构单元对象,而Elson-Morgan法、间苯三酚法以及咔唑法是目前比较常见的三种测定方法。

2.2.1Elson-Morgan法 Elson-Morgan法可以说是在硫酸软骨素含量测定中最早使用的一种测定方法,其测定原理主要是硫酸多糖降解产物可以在碱性条件下和乙酰丙酮进行相应的缩合,它的产物可以在525 nm波长处发生紫外吸收,因此能够以此测定其含量,但是也有较多研究指出［5,6］,该测定方法的操作步骤相对来说比较复杂,重现性比较差等。

2.2.2间苯三酚法 间苯三酚法属于应用比较普遍的一种多糖含量测定方法,其测定原理是在酸性条件下,将多糖降解成为单糖,之后再将单糖进一步分解为糠醛,它可和间苯三酚发生反应显色,同时能够在490 nm波长处发生紫外吸收,因此能够以此对多糖含量进行测定,间苯三酚法测定方法的操作相对比较简单,同时测定时间比较短。贾东升等［6］曾经分别采用间苯三酚法和Elson-Morgan法对硫酸软骨素的含量进行了测定,结果显示相比于Elson-Morgan法,间苯三酚法测定的含量要显著更高。

2.2.3咔唑法 咔唑法一般主要用于测定藻酸双酯钠以及甘糖酯等多聚糖醛酸类的含量,其测定原理是在强酸作用下,糖醛酸可以生成含有羧基的糠醛,它能够和咔唑发生反应并且显色,同时可以在530 nm波长处发生紫外吸收,因此能够测定多糖含量。目前有研究指出［6］,咔唑法具有较高的测量准确度,但是其不足之处为专属性较差。有研究曾经通过硫酸多糖类药物的离子强度以及其pH值,之后再选择氯化十六烷基吡啶选择性沉淀硫酸软骨素钠,分离硫酸软骨素钠,再通过咔唑法一起将两种多糖含量进行了测定,回收率理想。

2.3光度滴定法 硫酸多糖和氯化十六烷基吡啶,前者为酸性聚阴离子电解质,后者为含氮的阳离子表面活性剂,两者相互作用可以生成沉淀,如果条件适宜,可以形成混悬液,将其和对照品溶液比较透光度可以对硫酸多糖含量进行测定。在欧洲以及美国药典中,光度滴定法是测定硫酸软骨素含量的法定方法,但其在具体操作方面以及规定方面存在一定差异,但原理相同。

2.4液相色谱法

2.4.1柱前衍生-高效液相色谱法(HPLC) 单糖不仅具有较强的极性,同时其结构也比较相近,光学活性低,大部分衍生试剂大都基于还原胺化反应,其衍生期间反应时间相对较长,同时其反应衍生的产物也不是很稳定,因此容易对下一步分析造成较大的影响。还原性糖可以和PMP在温和条件下发生反应,同时不需要进行酸催化,可发生较强的紫外吸收,因此在单糖组成的研究中,有着广泛的应用［7］。

2.4.2柱后衍生-HPLC 有相关研究资料指出［7］,多种硫酸多糖的胍基类衍生物可存在荧光,用其进行糖类物质的衍生分析,可收获较高的分析准确性,同时如果和高效液相色谱法进行结合,还可对硫酸多糖类药物含量做出快速有效的测定。汲晨锋等［8］曾经将盐酸胍选择作为研究中的衍生试剂,通过荧光检测器对聚甘古酯的血药浓度进行了测定。

2.4.3离子色谱法 离子色谱法(IC)是在上世纪七十年代美国学者在离子交换色谱法的基础上研究出来的一种液相色谱技术,该技术将阴离子交换柱分离有关物质进行检测,在有机阴阳离子的检测以及无机阴阳离子的检测中得到成功且广泛的应用。除此之外,由于离子色谱法不需要衍生,且样品前无需进行任何处理,能够显著降低人力物力的消耗,因此在近几年的药品检测中得到迅速发展,特别是在糖检测中,其发展尤为迅猛。曾经有学者通过该方法不仅成功的分离了葡萄糖、麦芽糖以及核糖,同时还成功的测定出了葡萄糖、麦芽糖以及核糖的含量,进一步说明了在硫酸多糖含量测定中,离子色谱法的良好测定应用价值。

2.5生物效价法 肝素质量控制方法中,生物效价法是其法定控制方法,不仅在我国药典中引用了生物效价法,在美国、日本以及英国的药典中也引用了生物效价法。但是不同国家药典中生物效价法的操作以及相关具体要求略有不同。硫酸多糖类药物结构和肝素比较相似,由此在硫酸多糖类药物含量测定方法中,可以将肝素含量的测定方法作为参考即生物效价法。目前生物效价法主要有两类,一类是血液凝固法,另一类则是微量生色底物法。

2.5.1血液凝固法 血液凝固法种类较多,例如兔全血法、APTT法以及羊血浆法等,其全部都是通过将血浆的凝结时间进行延长来表征肝素含量以及纯度。

2.5.2微量生色底物法 此测定方法是通过对抗Ⅹa因子和抗Ⅱa因子活性进行测定后,以进一步分析肝素类药物的生物效价,以揭示其含量,微量生色底物法具有较强的专属性,除此之外,其检验的成本相对来说也比较低,因此目前已经有较多的国家选择将微量生色底物法作为肝素效价的测定方法。由于硫酸多糖类药物的硫酸根分布有着比较明显的规律性,因此能够通过对硫酸根含量进行测定来间接揭示硫酸多糖类药物含量,值得注意的是,此测定方法并不能够对多糖的实际含量做出有效表征。蔡超等［9］曾经通过酸水解法对肝素予以有机破坏,之后再通过离子色谱法对硫酸根含量进行针对性的测定,待样品溶解后,再对已经游离的硫酸根含量作进一步测定,最后再通过计算得出样品里面结合的硫酸根含量。

3 讨论

目前在所有的硫酸多糖类药物含量测定方法中,Elson-Morgan法、间苯三酚法、直接染色法以及咔唑法都是通过紫外分光光度计进行检测,这几种检测法在仪器要求上相对而言会比较低,同时花费也比较少,但是不足之处在于其重现性不佳,检测精密度不理想,因此会对检测结果带来较大影响。光度滴定法则是国外药典中对硫酸软骨素含量的一种法定检测方法,但是由于硫酸软骨素的水解产物为氨基半乳糖,不仅无法准确测出硫酸软骨素的真实含量,而且其结果的重现性也不理想。液相色谱法则是各国药典中对硫酸多糖含量测定的一种主流测定方法,不仅具有较高的精密度,不易产生较大误差,而且还可以在最大程度上反映出药物的真实含量。而对于生物效价法,由于该测定方法只对具有肝素样抗凝血作用的硫酸多糖比较适用,因此在实际应用中存在较大的局限性。总之,近几年硫酸多糖类药物因其特有的生物活性,受到了越来越多的学者的关注以及研究,而如何进一步提高硫酸多糖类药物含量的测定效果依旧是未来几年的研究重点之一。