李孟军，周 硕，李亚青，张士昌，彭义峰，张 楠，史占良

(1.石家庄市农林科学研究院/河北省小麦工程技术研究中心，河北石家庄 050041；2.河北省农林科学院遗传生理研究所，河北石家庄 050051)

小麦的每条染色体都具有与其同源染色体或其他2条部分同源染色体配对的潜力，但染色体配对在很大程度上仅限于同源染色体[1]。普通小麦5BL染色体臂上的Ph1位点是抑制部分同源染色体间配对和重组的主要因子[2-4]。在异源六倍体小麦中，5B染色体上的Ph1位点是在小麦多倍体化过程中产生的，它在减数分裂期间调控类二倍体化减数分裂(diploid-like meiosis)，抑制外源种属的部分同源染色体配对，从而保证小麦异源多倍体基因组的稳定性[5]。虽然在1958 年已鉴定了Ph基因，但由于缺乏等位变异，迄今Ph基因未被克隆[6]。Griffiths等[7]将Ph1定位在5B染色体上1段2.5 Mb区域中，该区域包含1段插入cdc2-like基因簇的亚端粒异染色质片段。cdc2-like基因簇是此区域唯一的多基因簇，其中至少1个成员是5B染色体特有的。因此，cdc2基因是Ph1最可能的候选基因[7]。定位在小麦基因富集区5L0.5的61个标记中，有9个位于Ph1基因区，其中7个标记以相同顺序排列定位在水稻9号染色体上450 kb区域上。在水稻450 kb区域中的91个基因中，鉴定出26个Ph1候选基因，其中5个基因与6个减数分裂特异基因(Zip1、Scp1、Cor1、RAD50、RAD51、RAD57)具有相同的结构域[8]。利用VIGS(virus-induced gene silencing)沉默侯选ph1基因C-Ph1(candidateph1gene,C-Ph1)导致了小麦表现出与ph1突变体类似的染色体配对行为。小麦部分同源群中的C-Ph1基因具有不同的结构和表达模式，只有5B染色体上的拷贝在减数分数中期Ⅰ特异性表达[9]。Sears 等[6]通过X-射线处理中国春小麦正常花粉获得了中国春ph1b突变体，该突变体能够有效引起部分同源染色体配对和种间、属间杂种染色体的配对。

在传统的回交育种过程中，将目标基因转入轮回亲本的同时，往往将非轮回亲本携带不利性状基因的染色体片段也转入轮回亲本基因组中。因此，减小携带目标基因的外源染色体片段是染色体工程中的重点和难点。为解决上述难题，需要做到以下两点：(1) 外源目标基因必须以易位染色体形式转入受体亲本，从而提高稀有重组体的出现频率；(2) 开发高效且成本低廉的分子标记，以便从大量杂交后代中筛选出稀有重组体[5]。

Segal等[12]根据DNA探针WPG90序列开发了分子标记WPG90。Qu 等[13]根据AFLP扩增片段开发了分子标记PSR2120。Roberts等[1,14]根据RFLP标记PSR128和PSR574分别开发了分子标记PSR128和PSR574。王新望等[15]根据RAPD特异片段OPR7936和OPR17524开发了 SCAR标记OPR7和OPR17，又根据大麦RFLP标记Ph920开发了SCAR 标记PhSCAR[16]。Mads是位于CSph1b缺失区的一个基因。雷 昊等[17]根据其DNA序列开发了分子标记Mads，成功地将中间偃麦草携带抗黄矮病基因的染色体2Ai-2转移到ph1b缺失的遗传背景中。本研究的目的是验证并比较上述9个PCR分子标记(WPG90、PSR2120、PSR128、PSR574、OPR7、OPR17、Ph920、PhSCAR、Mads)的特异性和稳定性，以期筛选出理想的分子标记，用于利用ph1b突变体的分子辅助育种。

1 材料与方法

1.1 供试材料

中国春ph1b突变体(CSph1b)，由山东农业大学孔令让教授和李兴锋教授提供；六倍体小麦Pavonph1b突变体(Pavonph1b)，由山东农业大学吴佳杰博士提供；中国春、中国春缺四体(CSN5AT5B、CSN5BT5A、CSN5DT5B)，由中国科学院李义文博士提供；含有ph1的小麦品种师栾02-1、石新828、石4185、郑麦366、济麦22和西农979，由河北省小麦工程技术研究中心提供。

1.2 供试分子标记

根据文献合成Ph1的9对PCR引物(表1)，分别用来检测CSph1b突变体及其转育的突变体Pavonph1b。PCR引物均由Invitrogen公司合成。

1.3 PCR检测

PCR反应在Biometra T-Gradient Thermoblock上进行。PCR反应体系(20 μL)：2×Taq PCR StarMix(GenStar)10 μL，引物各1 μL(10 μmol·L-1)，模板基因组DNA 2 μL(50～100 ng)，ddH2O 6 μL。PCR 扩增程序参照文献并加以优化(表2)。PCR扩增产物采用2.0%琼脂糖凝胶电泳检测，缓冲液为1×TAE，溴化乙锭染色观察记录。

1.4 序列分析

采用克隆测序方法对PSR128、Mads和PhSCAR三个标记的PCR产物进行了序列分析。PCR反应在Biometra T-Gradient Thermoblock上进行。PCR反应体系(20 μL)： 2× LA Taq PCR MasterMix(TaKaRa)10 μL，引物各1 μL(10μmol·L-1)，模板基因组DNA 2μL(50～100 ng)，ddH2O 6 μL。克隆载体为pMD18-T(TaKaRa)。测序由Invitrogen公司完成。用软件Lasergene SeqMan II Module (DNAStar; http:/www.DNAStar.com)进行核酸序列组装、拼接和比对。

表1 PCR分子标记及其引物序列Table 1 PCR marker information and primer sequences

表2 PCR扩增程序Table 2 PCR program

2 结果与分析

通过对相关文献的分析，选取了其中9个分子标记，以11个基因组DNA为模板，对这9个分子标记进行了验证和比较。在9个分子标记中，Mads是根据CSph1b缺失区的Mads基因开发的，其余8个标记为根据RFLP、AFLP和PAPD标记开发的SCAR标记。为了简化PCR操作，提高PCR检测效率，本研究中PCR扩增均以基因组DNA为模板，采用了相同的PCR扩增体系，并对每个标记的PCR扩增程序进行了简化和优化(表2)。

PCR扩增结果表明，9个标记中，WPG90、PSR2120、PSR128、PSR574、Ph920、Mads为显性标记，在CSph1b突变体和Pavonph1b突变体中无扩增，而在含有Ph1的小麦品种中，这6个标记均扩增出特异的单一条带，片段大小分别为230 bp、232 bp、260 bp、154 bp、920 bp和323 bp(PCR产物直接测序)，符合预期[5,12-14,16-17]。CSph1b突变体、Pavonph1b突变体和中国春缺四体CSN5BT5A PCR扩增带型一致，这表明Ph1位点位于5B染色体上，Pavonph1b突变体来自CSph1b突变体[4](图1)。标记Ph920采用参考文献的PCR程序，CSph1b突变体、Pavonph1b突变体和中国春缺四体CSN5BT5A有较弱的非特异性扩增。标记PSR2120有引物二聚体产生，通过调整退火温度无法消除引物二聚体。标记WPG90对退火温度非常敏感，仅在58 ℃有微弱的PCR扩增。标记PSR128和标记PSR574扩增条带特异、清晰、单一，同时，2个标记PCR扩增对退火温度不敏感，适宜作为多重PCR扩增引物。标记OPR7和标记OPR17在所有DNA模板中均有扩增，无法区分CSph1b突变体和Pavonph1b突变体，是非特异PCR标记，与预期不符[17]。标记PhSCAR在所有DNA模板中均有扩增条带，但CSph1b突变体、Pavonph1b突变体、中国春缺四体CSN5BT5A三个材料与其他8个材料的PCR扩增带型不同，与预期不符[16]。标记PhSCAR在CSph1b突变体、Pavonph1b突变体和中国春缺四体CSN5BT5A中扩增出单一条带，而在含有Ph1的小麦品种中均扩增出2个条带，这种扩增特征稳定，因此，标记PhSCAR可作为共显性标记使用(图1)。

A：WPG90；B：PSR2120；C：PSR128；D：PSR574；E：OPR7； F：OPR17；G：Ph920；H：Mads；I：PhSCAR。M：DNA marker(DL2000)；1：CSph1b；2：Pavonph1b；3：CSN5AT5B；4：CSN5BT5A；5：CSN5DT5B；6：师栾02-1；7：石新828；8：石4185；9：郑麦366；10：济麦22；11：西农979；12：ddH2O。

A:WPG90; B:PSR2120; C:PSR128; D:PSR574; E:OPR7; F:OPR17; G:Ph920; H: Mads;I：PhSCAR.M: DNA marker(DL2000); 1:CSph1b; 2:Pavonph1b; 3:CSN5AT5B; 4:CSN5BT5A; 5:CSN5DT5B; 6:Shiluan 02-1; 7:Shixin 828; 8:Shi 4185; 9:Zhengmai 366; 10:Jimai 22; 11:Xinong 979; 12:ddH2O.

图1 9个DNA分子标记的PCR检测结果

Fig.1 PCR assay amplified with the nine molecular markers

标记Mads扩增中，退火温度不同，CSph1b突变体、Pavonph1b突变体和中国春缺四体CSN5BT5A PCR扩增带型不同。扩增产物测序结果表明，PCR带型的差异是因为标记Mads的上链引物和下链引物各自分别发生了扩增，扩增片段长度分别为878 bp和1584 bp[17](图2B)。

A：Mads (Tm=64 ℃)；B：Mads(Tm=56 ℃)。M：DNA marker(DL2000)；1：CSph1b；2：Pavonph1b；3：CSN5AT5B；4：CSN5BT5A；5：CSN5DT5B；6：师栾02-1；7：石新828；8：石4185；9：郑麦366；10：济麦22；11：西农979；12：ddH2O。

A: Mads (Tm=64 ℃); B:Mads (Tm=56 ℃).M:DNA marker(DL2000); 1:CSph1b; 2:Pavonph1b; 3:CSN5AT5B; 4:CSN5BT5A; 5:CSN5DT5B; 6:Shiluan 02-1; 7:Shixin 828; 8:Shi 4185; 9:Zhengmai 366; 10:Jimai 22; 11:Xinong 979; 12:ddH2O.

图2 分子标记Mads在不同退火温度下的PCR检测结果

Fig.2 PCR assay amplified with Mads at different annealing temperatures

3 讨 论

黑麦属、偃麦草属、冰草属、簇毛麦等普通小麦近缘种属蕴藏着普通小麦缺乏的优良基因，通过远缘杂交将其优良基因导入小麦基因组中，对普通小麦遗传改良具有重要意义。Ph1b突变体可诱导普通小麦与近缘物种部分同源染色体的重组[4]，通过与部分同源染色体配对重组创制的普通小麦外源染色体小片段易位系，可减少近缘物种携带目标基因的染色体片段对小麦农艺性状的不利影响。CSph1b突变体为春性小麦且农艺性状较差，通过回交创制适宜本区域农艺性状优良的ph1b突变体，有利于提高ph1b的育种利用价值[16]。利用ph1b突变体创制普通小麦和外源染色体重组体效率较低，且需采用特定的杂交策略，因此，在回交过程中采用分子标记辅助选择技术可以显著加速新种质创制进程，甚至决定新种质选育的成败[6]。

王新望等[16]以阿勃5B缺体为桥梁亲本，京411为受体亲本, CSph1b突变体为供体亲本，经减数分裂分析和PhSCAR标记辅助选择，快速地选育了京411的ph1b中间代换系。雷昊等[17]用CSph1b分子标记Mads 及2Ai-2 染色体的分子标记P4和P68高效获得了小麦-中间偃麦草ph1b-2Ai-2 染色体综合体。本实验结果表明，分子标记WPG90、PSR2120、PSR128、PSR574、Ph920、Mads能够用于ph1b纯合单株选择，其中标记PSR128、PSR574和Mads从特异性、重复性方面考虑适用于分子标记辅助选择，但标记Mads需要注意退火温度的选择。标记PhSCAR与前人研究结果[16]不同，PCR扩增及其产物测序结果表明，标记PhSCAR可作为共显性标记使用。共显性标记的PCR分子标记可有效避免显性分子标记中的假阴性现象。在ph1b株系选择时，标记PhSCAR与PSR128、PSR574、Mads配合使用可相互验证，从而减少杂交和选择的工作量，提高鉴定的准确性。标记OPR7和OPR17无法有效区分ph1b株系，这与前人研究结果[15]不同，具体原因需进一步研究。