刘朦朦，张萌娜， 张倩倩，刘锡建，郭宇航，孙靳惠，武亚瑞，王素容，吴永振，孙 晗，崔 法，赵春华

(鲁东大学农学院,山东烟台 264025)

作物干物质积累和产量形成的基础是光合作用，叶片是作物光合作用的主要器官[1-2]。旗叶是小麦生长后期光合效率最高的叶片，对光合作用的贡献率占全部叶片光合作用贡献率总和的 45%～58%[3-4]。旗叶的光合产物是小麦籽粒碳水化合物的重要来源[5]，提供了籽粒灌浆所需碳水化合物总量的 41%～43%[6]，对小麦籽粒产量的贡献可达 1/3[7]，在籽粒和产量形成中起着重要的作用。旗叶性状主要包括旗叶长、旗叶宽和旗叶面积。旗叶性状对小麦产量影响很大，旗叶宽的影响显著高于旗叶长和旗叶面积，旗叶越宽，叶片气孔导度及胞间CO2浓度越大，越有利于气体交换的进行和CO2的供应[8]。小麦旗叶宽度与籽粒硬度等品质性状呈极显著正相关[9]。因此挖掘与旗叶宽相关的优异等位基因，开发分子标记，进一步开展分子标记辅助选择育种，将大大加快小麦优异品种的选育进程，为小麦产量性状分子育种提供优异基因资源和选择工具。

小麦旗叶宽是受多基因控制的数量性状，遗传基础复杂。随着分子生物学和生物统计的发展，以分子标记遗传图谱和各种统计模型为基础的数量性状位点(quantitative trait loci,QTL)作图技术，为研究数量性状遗传提供了有效的技术手段[10]。目前，国内外有关旗叶性状的QTL 研究已有诸多报道，Nalini等[11]确定了 25个关于旗叶长、旗叶宽和秆长的QTL；Fan等[12]在 8个环境中检测到控制旗叶长、旗叶宽和旗叶面积的共 38个QTL；Wu等[13]在 4个环境中检测到 11个有关旗叶宽的QTL；Hussain等[14]在4个环境中检测到控制旗叶长、旗叶宽和旗叶面积的 30个QTL；Zhao等[15]在 4个环境中共检测到 31个有关旗叶长、旗叶宽和旗叶面积的QTL；逯腊虎等[16]在小麦第四部分同源群上定位出 3个有关旗叶宽稳定表达的主效QTL。但目前对于旗叶性状遗传效应解析的报道并不多见。

本课题组利用科农 9204与京 411构建的重组自交系群体(KJ-RILs)在5B染色体上定位了一个控制旗叶宽的主效QTLQFlw-5B[12]。本研究在其基础上利用SNP标记进一步对QFlw-5B靶区段染色体进行加密，构建高密度遗传图谱，进而对QFlw-5B进行定位，以期找出与其紧密连锁的分子标记并进行单倍型分析，明确其在育种上的应用，为品种的遗传改良提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试材料为科农 9204、京 411及其 188个家系组成的重组自交系群体(KJ-RIL)，由中国科学院遗传与发育生物学研究所农业资源研究中心李俊明研究员课题组提供。田间种植包括 8个环境，分别为 2011-2012年石家庄高氮环境(E1)，2011-2012年石家庄低氮环境(E2)，2012-2013年石家庄高氮环境(E3)，2012-2013年石家庄低氮环境(E4)，2012-2013年北京高氮环境(E5)，2012-2013年北京低氮环境(E6)，2012-2013年新乡高氮环境(E7)，2012-2013年新乡低氮环境(E8)，其相关性状调查参照Fan等[12]的方法。310份育成品种(系)由本课题组收集和保存，其中包含 197份审定品种，详见附表1。

1.2 QFlw-5B靶区段定位

结合前期QFlw-5B旗叶宽QTL定位结果[12]及靶区段分子标记探针信息[17]，通过BLAST将靶区段分子标记锚定于中国春参考基因组IWGSC RefSeq v1.0。利用完备区间作图[18]软件IciMapping v4.1(http://www.isbreeding.net/)和MapQTL 6.0对旗叶宽QTLQFlw-5B作进一步定位。

1.3 基因型扫描及数据处理

采用 SDS-酚法[19]从植株幼叶中提取DNA。利用小麦55K Affymetrix 芯片对 310份育成品种(系)组成的自然群体进行基因型鉴定，由北京康普森生物技术有限公司(http://www.kangpusen.com/)杂交分型获得相关探针对应材料的基因型。利用NCBI进行BLAST分析(ftp://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/blast/executables/release/)，将每个SNP探针侧翼序列与中国春的参考基因组IWGSC RefSeq v1.0进行比对，以明确SNP对应的物理位置。结合310份自然群体基因型鉴定结果，在靶区段内确定3个标记AX-111065169(5B595513567)、AX-110922298(5B596618615)和AX-110913121(5B598056157)进行自然群体的单倍型分析。其中，优异单倍型为AAA，非优异单倍型为BBB，重组型为AAB、ABB、 BAA和BAB，杂合型为ABH、 AHA、 AHB、 AHH、 HAA、 BAH、 HAB、 HAH、 HBB和BHB。

2 结果与分析

2.1 QFlw-5B靶区段高密度遗传连锁图谱构建结果

在原图谱基础上[12]，构建高密度遗传连锁图谱，5B染色体新加密SNP标记 5 938个[20]，进一步缩小了QFlw-5B靶区段的置信区间。图1为5B靶区段染色体分子标记加密之前低密度连锁图谱和加密之后高密度连锁图谱的比较，加密后图谱明显缩小了标记间的平均遗传距离。

图1 QFlw-5B靶区段高密度遗传连锁图谱及 QFlw-5B加密前后位置比较(加密前区间为80～110 cM，加密后区间为65～69 cM)

2.2 QFlw-5B在高密度遗传图谱的定位

利用两个软件(IciMapping 4.1 和 MapQTL 6.0)对QFlw-5B在高密度图谱上进行进一步定位，两个软件均在 7个环境中(E1除外)检测到在5BL染色体上的AX-110978403～AX-111671812区间内有1个控制旗叶宽的主效QTL，LOD峰值也出现在此区间的61.22～68.60 cM遗传距离范围内，LOD值为4.05～8.81(表1)，能够解释9.40%～19.76%的旗叶宽表型变异，来自科农 9204的等位基因增加旗叶宽 0.04～0.07 cm。

表1 基于高密度遗传图谱7个环境下 QFlw-5B的定位结果Table 1 Location of QFlw-5Bin seven environments based on high-density genetic map

2.3 QFlw-5B对产量性状的遗传效应

基于QFlw-5B紧密连锁标记(LOD峰值下标记) AX-108884656对 188个KJ-RIL 进行基因型分组，结合其 8个环境下产量相关性状表型数据进行方差分析，结果(图2)表明，来自科农 9204的优异等位基因相对于京 411等位基因在增加旗叶宽的同时，8个环境下均能够增加穗粒数，且对穗粒数的影响在E7下达到极显著水平(P<0.01)。优异等位基因在 6个环境下能增加千粒重(E2和E8除外)和单株产量(E4和E5除外)，平均单株产量增加 1.31%，而对单株穗数有一定的负效应。

2.4 QFlw-5B靶区段在育成品种中的遗传解析

2.4.1QFlw-5B靶区段单倍型分析

根据 310份育成品种(系)的芯片分析及SNP的物理位置信息，在QFlw-5B靶区间选取 3个SNP 标记AX-111065169、AX-110922298和AX-110913121对310份育成品种(系)进行单倍型分析，靶区段优异单倍型(科农 9204基因型，AAA)所占比例为 16.13%；非优异单倍型(京 411基因型，BBB)所占比例为 7.10%；重组型个体占 57.74 %；靶区段处于杂合状态的材料占 10.32 %(表2)。

2.4.2QFlw-5B靶区段单倍型在不同省份的选择效应分析

在271个育成品种(系)(表3)中，青海省含QFlw-5B靶区段优异单倍型的品种占其品种总数的比例最高，为 35%，重组型也占35%；其次是河南省，含QFlw-5B靶区段优异单倍型的品种占32%，重组型占42%；河北省材料中，含靶区段优异单倍型的品种占 22%，重组型占 69%；四川省材料中，含靶区段优异单倍型的品种占20%，重组型占 57%；北京市材料中，含靶区段优异单倍型的品种占 5%，重组型品种占 50%；山东省材料中，含靶区段优异单倍型品种占 5%，重组型品种占 79%。西藏，安徽省、云南省、陕西省、山西省、内蒙古自治区和甘肃省等省份的材料由于数量过少，在这里不做统计分析。

AAA:等位基因来自科农9204的KJ-RIL；BBB：等位基因来自京411的KJ-RIL； **：AAA与BBB在E7环境下差异极显著(P<0.01)。

AAA: KJ-RIL containing the allele derives from Kenong 9204; BBB: KJ-RIL containing the allele derives from Jing 411; **: The differences between AAA and BBB are significant under E7(P<0.01).

图2QFlw-5B对产量性状的遗传效应

Fig.2 Genetic effect ofQFlw-5Bon yield related traits

表2 310份高代育成品种(系)的 QFlw-5B单倍型分析Table 2 Haplotype analysis of QFlw-5Bin the 310 high generation varieties(lines)

优异单倍型为AAA；非优异单倍型为BBB；重组型包括AAB、ABB、BAA和BAB；杂合型包括ABH、AHA、AHB、AHH、HAA、BAH、HAB、HAH、HBB和BHB。表3同。

The excellent haplotype is AAA; The non-excellent haplotype is BBB; The recombinant type include AAB,ABB,BAA and BAB; The heterozygous type include ABH,AHA,AHB,AHH,HAA,BAH,HAB,HAH,HBB and BHB.The same in table 3.

2.4.3 含QFlw-5B优异单倍型的品种

对 310个品种(系)中的 45个含QFlw-5B优异单倍型的品种按省份来源分析(表4)。其中，青海省和河南省含有优异单倍型的品种最多，都为 12个品种；其次是四川省，有9个含优异单倍型的品种；山东省材料中，优异单倍型品种为 6个；河北省材料中，优异单倍型品种为 5个；北京市材料中只有 1个优异单倍型品种。可见，大多数省份材料中优异单倍型的个数均较少。

3 讨 论

在本研究中，QFlw-5B靶区段锚定到5BL物理图谱上，对应于5B:594145232～602570956的物理区间。在前人的研究中，Edae等[21]在5B:576921577的物理位置附近检测到与穗粒数相关的QTL。Wang[22]和 Golabadi[23]在5B:577086664的物理位置附近，检测到与千粒重、穗粒重相关的QTL[22-23]。Zhang等[24]在5B:61984378～5B:634179670的物理区间内检测到与千粒重相关的QTL。Liu等[25]在5B:598031683的物理位置附近检测到与穗粒重相关的QTL。可见，靶区段附近存在与产量性状相关的QTL位点。

本研究中，利用与QFlw-5B紧密连锁分子标记对产量相关性状进行了分析，发现增加旗叶宽的标记同时对穗粒数、千粒重和单株产量有一定的增效作用，对单株穗数有一定的负效应，这与Zhao等[15]研究结果一致，因此在小麦育种中应对宽旗叶的材料进行适当的选择。

表3 不同省份品种(系)的 QFlw-5B 单倍型分析Table 3 Haplotype analysis of QFlw-5Bin varieties(lines) from different provinces

表4 含 QFlw-5B 优异单倍型的品种(系)Table 4 Varieties(lines) of QFlw-5Bexcellent haplotype

QFlw-5B靶区段在 310份小麦育成品种(系)中的单倍型分析表明优异单倍型在育种材料中已得到选择，但选择程度在不同省份各有差异。QFlw-5B靶区段优异单倍型在源于青海省和河南省的材料中占比较高，表明QFlw-5B靶区段优异单倍型在青海春麦、冬麦及河南冬麦育种中已被育种家优先选择，但是在源自北京市和山东省的材料中，QFlw-5B靶区段优异单倍型占比较低，仅为 5%，表明QFlw-5B靶区段优异单倍型在黄淮冬麦区育种中还未被育种家选择。而重组型品种在所有省份中所占比例均较高，表明小麦旗叶宽改良还有很大空间。