黄育涛 蔡幸生 朱勇斌

揭阳市人民医院(揭阳 522000)

肺炎(Pneumonia)是儿童的一种主要常见病, 其中绝大部分儿童肺炎为社区获得性肺炎(community acquired pneumonia,CAP)。引起CAP的病原微生物包括细菌、病毒、肺炎支原体、肺炎衣原体、真菌等[1- 2]，近年来肺炎支原体(mycoplasma pneumonia,MP)感染的肺炎比例有所增加,10%～40%的住院儿童CAP是由肺炎支原体感染引起的[3- 4]。肺炎支原体肺炎(mycoplasma pneumonia pneumonia,MPP)的诊断除了要具备肺炎的表现和/或影像学依据外，还要结合MP病原学检查。核糖核酸恒温扩增技术(RNA simultaneous amplification and testing,RNA-SAT)是新一代病原体检测技术，能快速准确检测出活的病原体，可用于早期诊断[5]。近年来RNA-SAT已开始应用于儿童MP病原学检测，但对其临床应用价值的报道较少。本研究通过对310例CAP的MP RNA-SAT和MP-IgM检测结果进行回顾性比较分析，旨在探讨MP RNA-SAT对儿童社区获得性肺炎早期诊治的价值。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选择广东省揭阳市人民医院儿科住院部2018年 1月—2019年 6 月收治的CAP患儿310例临床资料进行回顾性分析，其中MPP组155例，男75例、女80例，年龄4月～13岁；非MPP组155例，男78例、女77例，年龄5月～12岁。两组患儿一般资料无明显差异，具有可比性。

1.2 入组标准

所有患儿的临床诊断均符合社区获得性肺炎[2]，MPP组的患儿符合肺炎支原体肺炎的诊断标准[6]；非MPP组则不符合，且存在其他病原体感染的实验室检查证据。

1.3 检验方法

1.3.1 标本采集：两组患儿均于入院24小时内予无菌采集咽拭子标本行MP RNA-SAT检测和采集静脉血做MP IgM检测。

1.3.2 MP RNA-SAT检测：①T7核酸扩增:向标本中加入20 μL细胞裂解液，旋涡震荡30 s，室温裂解10～15 min，95 ℃孵育2 min，42 ℃稳定2 min后，加入1 μL扩增酶混匀，42 ℃恒温扩增60 min。②多生物素信号放大检测:将15 μL扩增产物和4 μL放大探针稀释到200 μL 42 ℃的杂交液中，混匀，每孔加60 μL到微板孔内，并向每孔加入10 μL相应的特异探针；贴上封板膜，50 ℃孵育60 min;除去封板膜，每孔加入200 μL预热的洗液A洗板，重复3次；然后每孔加入200 μL封闭液，弃去孔内液体，每孔再加入100 μL酶联物；42 ℃孵育10～15 min，向每孔加入200 μL预热的洗板液B洗板，重复3次；按底物稀释液:底物A:底物B=8:1:1的比例配制底物工作液，每孔加入95 μL底物工作液，1 min内置于化学发光仪上进行相对光单位(RLU)测定，仪器自动进行结果判断。所有操作均严格按照设备和试剂说明及实验要求进行。使用设备、试剂：化学发光检测仪TZD-CL- 200S(厦门天中达生物科技有限公司)，迷你金属浴(杭州奥盛仪器有限公司)，肺炎支原体肺炎衣原体核酸检测试剂盒(双扩增法)(武汉中帜生物科技股份有限公司)。

1.3.3 MP-IgM检测：取20 μL全血样本加到试剂条指示箭头下端边缘加样处，垂直滴加2滴(约100 μL)样本稀释液，5～10 min内若出现检测线和质控线，判为阳性；若仅出现质控线，且10 min内未出现检测线，判为阴性，10 min后判读结果无效。所选试剂：肺炎支原体IgM抗体检测试剂(胶体金法)(珠海丽珠试剂股份有限公司)。

1.4 统计学方法

应用SPSS 17.0统计软件，计数资料采用χ2检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 检验结果

具体见表1。

表1 两组患儿MP检验结果 例

2.2 RNA-SAT和IgM诊断MPP的准确性比较

RNA-SAT的特异度及阳性预测值高于IgM，而敏感度及阴性预测值则低于IgM，差异有统计学意义(P<0.05)，见表2所示。

表2 RNA-SAT和IgM诊断MPP的准确性比较 %

2.3 影响RNA-SAT检出率的相关因素

将性别、年龄、检测时间、本次病程是否使用大环内酯类药物和检测标本分别作为影响RNA-SAT检出率的可能因素进行单因素分析，结果发现年龄>3岁、检测前不使用大环内酯类药物以及选择肺泡灌洗液作为检测标本均能提高RNA-SAT的检出率，结果差异有统计学意义(P<0.05)；性别和检测时间对RNA-SAT的检出率无影响(P>0.05)，见表3。

表3 RNA-SAT在不同因素影响下的检出率

3 讨 论

CAP是指社区(医院外)发病的感染性肺炎，包括了在社区感染病原体而在医院发病的肺炎。MP是CAP的主要病原体之一，肺炎支原体肺炎治疗首选是阿奇霉素[6- 7]。随着大环内酯类抗生素在儿童呼吸道疾病中的大量应用，大环内酯类耐药的肺炎支原体肺炎逐渐增加[8- 10]。冯雪莉[11]等报道的首都医科大学附属北京儿童医院儿童肺炎支原体肺炎的耐药比例高达86.7%，早期诊断并及时有效的抗生素治疗对控制耐药形势的蔓延尤为重要。肺炎支原体肺炎具有症状体征不典型、影像学改变多样化的临床特点[12]，诊断难度偏大，所以快速准确的病原学检查对肺炎支原体肺炎的早期诊断意义重大。目前MP病原学检测方法有分离培养、血清学检测、核酸检测(DNA和RNA)3类方法，其中MP常规培养需要时间较长，对早期诊断意义不大，快速培养则敏感度及特异度均较差。MP抗体在感染1周后出现，可长期存在，即使在疾病痊愈后仍可存在1～3个月以上，不好区分是现症感染还是既往感染；恢复期和急性期MP-IgM抗体滴度呈4倍或4倍以上增高或减低时可确诊为MP感染，这需在急性期和恢复期各采集血液标本，花费时间长，不利于临床早期诊断[7，13]。MP-DNA在体内持续携带的中位时间是其感染后7周，个别长达7月，所以DNA检测无法区分现症感染与携带状态，需动态观察[14]。RNA-SAT作为一种新型的分子生物诊断技术，能针对病原体的靶标RNA实现特异度的扩增和检测，由于RNA只存在于增殖存活的病原体内，能够区分感染和携带，同时具有极高的灵敏性，更适用于临床早期诊断[15]。

本研究对310例CAP患儿(其中MPP组155例，非MPP组155例)的MP检测结果进行回顾性分析，发现RNA-SAT的特异度及阳性预测值明显高于IgM，意味着RNA-SAT(+)能更加准确地反映MP的现症感染，RNA-SAT可以弥补单次IgM检测假阳性偏多的不足，从而减少MPP的过度诊断。而IgM在敏感度及阴性预测值方面比较有优势，说明IgM(-)能更好地排除MP感染，同时也要注意到是否存在着标本采集操作不当引起RNA-SAT假阴性增多，进而导致RNA-SAT敏感度偏低的可能性。

对于可能影响RNA-SAT检出率的因素进行单因素分析，结果提示年龄>3岁、检测前不使用大环内酯类药物以及选择肺泡灌洗液作为检测标本均能提高RNA-SAT的检出率，考虑可能是下列原因导致：①年龄大的患儿在取检过程比较配合，容易取到合格的检测标本；②RNA-SAT检测的目标是存活的病原体的RNA，检测前使用大环内酯类药物治疗可导致部分MP被清除，从而出现相应的那部分结果阴性；③咽拭子与肺泡灌洗液相比，容易受到咽部正常定植菌和取检操作的影响，所以检出率比肺泡灌洗液的低。

综上所述，由于MP感染后MP-IgM在体内持续时间过长，容易出现假阳性，临床工作中仅予MP-IgM抗体检测可能存在较大误诊风险，导致滥用抗生素，进而增加抗生素耐药风险。MP RNA-SAT能准确识别出活动性感染，联合使用RNA-SAT和IgM检测并综合分析，能更加快速、准确地诊断MP感染，有利于临床合理使用抗生素，减少抗生素耐药风险，对儿童肺炎的诊治具有较高的价值，值得临床医师借鉴。在使用RNA-SAT检测时，尽量在使用大环内酯类药物治疗前由经过专门培训的工作人员进行咽拭子取检，必要时可选择肺泡灌洗液进行检测以提高检出率。