黄千峰 武 丽 欧燕兰 艾 君 张 秀

广东省妇幼保健院(广州 511400)

卵巢癌(ovarian cancer，OC)是妇科癌症相关死亡的最常见原因，我国卵巢癌患者的死亡率在2000年—2003年、2003年—2011年分别上升了21.6%和1.7%，在所统计的多种肿瘤中居首位[1]，我国的癌症调查结果显示，OC起病隐匿，约75%的病例诊断时已为晚期(FIGO Ⅲ～Ⅳ期),患者预后差[2]，世界范围内每年23万例女性诊断为OC，15万例女性死于OC[3]。 OC的病死率高，以细胞减灭手术和以铂类与紫杉醇为基础的化疗为主要治疗方法，但晚期OC患者的5年生存率仅5%～30%。OC的治疗通常是以铂类药物、紫杉醇为基础化疗，患者对该类化疗反应良好，但药物的特异度不高，耐药性已成为治疗OC的关键障碍[4]，化疗耐药成为困扰妇科医生的难题，因此，发掘新的抗肿瘤药物具有重要的临床意义。

细胞毒素(cytotoxin, CTX)是眼镜蛇毒的主要毒性成分之一，是从眼镜蛇毒中分离出的毒性蛋白，约占粗毒总蛋白40%左右，又称心脏毒素[5]。是由60～ 63个氨基酸组成的单链多肽, 分子量约为6 700 Da,CTX对多种细胞均具有细胞毒性，对许多肿瘤细胞具有选择性抑制增殖作用，在抗肿瘤研究中引起了广泛重视，国内外众多研究表明其可阻断乳腺癌细胞MDA-MB- 231的迁移与侵袭[6]，对早幼粒白血病细胞HL60和肺腺癌细胞A549等多种肿瘤细胞有选择性杀伤作用[5,7]，开展CTX- 1抗肿瘤研究前景十分广阔。目前有关其抑制卵巢癌细胞增殖的作用的研究较少。为此，本研究观察CTX- 1对人卵巢癌SKOV- 3细胞活性的影响，为其抗卵巢癌提供新的证据。

1 材料与方法

1.1 材料

人卵巢癌SKOV- 3细胞株(中国科学院上海细胞研究所)；DMEM高糖培养基(美国Invitrogen Gibco公司)、青霉素-链霉素双抗溶液(美国GIBCO公司)；TRIzol Reagent(Ambion)；Hoechst33258染色试剂盒(南京凯基科技有限公司)；Annexin V -FITC/PI凋亡检测试剂盒(Invitrogen公司)；胰蛋白酶(0.25% Trypsin、0.25% Trypsin-EDTA)(Gibco 加拿大)；CTX- 1(广州医科大学实验室提供)。

1.2 方法

1.2.1 人卵巢癌SKOV- 3细胞培养 用含10%胎牛血清的DMEM高糖培养基培养SKOV- 3细胞株。将SKOV- 3细胞置于湿度95%的恒温培养箱(5% CO2、37 ℃)中，2 d传代1次，传代比例为1:2，维持细胞处于对数生长期。倒置显微镜下观察细胞形态变化情况。

1.2.2 MTS法检测CTX1对人卵巢癌SKOV- 3细胞活力的影响 取处于对数生长期的人卵巢癌SKOV- 3细胞，0.25%胰酶消化重悬，加入96孔培养板中，于5% CO2、37 ℃恒温培养箱培养24 h，实验设不同浓度的CTX1作用组(4、8、12 μg/mL)[7]和实验对照组(仅为细胞悬液，不加入CTX- 1)，用相应浓度药物培养基继续培养6、12、24 h观察不同浓度CTX- 1对卵巢癌细胞 SKOV- 3存活率的影响。每孔分别加入20 μL MTS检测液，培养4 h，每孔加入 CCK8 溶液10 μL，培养3 h，酶标仪490 nm处测定吸光度(A)值，计算细胞相对活力，细胞活力 (%)=[A(加药)-A(空白)]/[A(0加药)-A(空白)]×100 %。

1.2.3 Hoechst- 33258荧光染色观察SKOV- 3细胞核形态变化 取对数生长期的SKOV- 3细胞，消化细胞按2×105个/孔，将其种植于6孔板爬片，培养6～8 h贴壁，加入浓度为8 μg/mL CTX- 1培养基2 mL，对照组只加等体积完全培养基，分别24 h、48 h后吸尽液体，加入固定液，固定10 min后加入Hoechst- 33258染色。调整荧光显微镜的激发波长到350 nm，发射波长到460 nm，上机观察细胞核的形态。

1.2.4 流式细胞术检测Annexin V-FITC/PI双染后SKOV- 3细胞凋亡情况 消化计数细胞，按 6×105/皿的细胞数接种在培养皿中，待细胞完全贴壁，加入8 μg/mL浓度CTX- 1 2 mL，对照组只加入等体积完全培养基，6、12 h去掉培养基，消化后离心收集细胞，重悬细胞于100 μL的1×Annexin-binding buffer溶液中，加入5 μL Annexin V-FITC染液和1 μL 100 μg/mL PI工作液，摇匀室温下反应15 min,再加400 μL 1×Annexin-binding buffer溶液，阴性对照孔只加500 μL 1×Annexin-binding buffer，上机检测。

1.3 统计学分析

2 结 果

2.1 MTS法检测CTX- 1对人卵巢癌SKOV- 3细胞活力的影响

MTS法检测显示，伴随处理药物浓度的增加、处理时间的延长，SKOV- 3细胞的活力逐渐下降 (图1)。表明CTX- 1可抑制SKOV- 3细胞活力，抑制其在体外的增殖能力，与对照组相比，差异有统计意义(P<0.01)。

图1 不同浓度CTX- 1处理不同时间后SKOV- 3细胞活力抑制率与对照组比较， *P<0.01

2.2 Hoechst- 33258荧光染色观察8 μg/mL CTX- 1处理后SKOV- 3细胞核的形态学变化

CTX- 1 8 μg/mL作用于人卵巢癌SKOV- 3细胞24 h、48 h，镜下对照组细胞核完整，着色均匀，荧光黯淡；CTX- 1处理后24 h、48 h，染色质凝聚，细胞核呈致密浓染，或呈碎块状致密浓染，着色不规则，呈现细胞凋亡核碎裂典型变化，而且随时间增加而更趋明显(图2)。

2.3 流式细胞术检测8 μg/mL CTX- 1处理SKOV- 3细胞Annexin V-FITC/PI双染后凋亡情况

用8 μg/mL CTX- 1处理后SKOV- 3细胞6 h、12 h后上机检测，发现晚期凋亡和坏死(右上象限)细胞较为明显，而早期凋亡(右下象限)不明显。对照组凋亡率(3.24±0.47)%；8 μg/mL CTX- 1处理细胞 6 h、12 h 后，6 h细胞坏死率为(1.90±0.27)%，晚期凋亡率为(10.96±1.56)%、而早期凋亡率为(1.52±0.39)%，与对照组凋亡率相比P=0.001 1、F=15.16，差异有统计学意义；12 h细胞坏死率为(10.62±0.96)%，晚期凋亡率为(15.07±1.23)%、而早期凋亡率为(1.88±0.17)%，与对照组凋亡率相比P=0.000 1、F=8.873，差异有统计学意义；说明CTX- 1能诱导人卵巢癌SKOV- 3细胞发生凋亡，并呈时间依赖效应，与对照组相比，差异有统计学意义(P<0.01)(图 3)。

图2 用8 μg/mL CTX- 1处理后SKOV- 3细胞(×400)

3 讨 论

卵巢癌是女性生殖系统恶性肿瘤，对妇女生命造成严重的威胁，且其发病率和死亡率有逐年升高的趋势，死亡率占妇科恶性肿瘤首位[8]。由于大部分患者确诊时就已是进展型卵巢癌，预后较差，死亡率高，对人类的生命健康造成了极大的威胁[9]，卵巢癌早期症状比较隐匿、进展迅速，为妇科的三大恶性肿瘤之一，OC患者的死亡率在2000年—2003年、2003年—2011 年分别上升了21.6%和1.7%，在所统计的多种恶性肿瘤中居首位[1]，患者5年存活率为46%。目前治疗仍是手术辅以铂类药物为基础的化疗，该法对早期患者效果显著，但较多晚期患者易复发和产生耐药，导致预后不佳[2]，化、放疗加手术是临床治疗OC的常规主要手段，但随着药物的使用，耐药问题和药物毒副作用越来越明显，耐药成为OC复发和治疗失败的主要原因[10]，天然化合物在恶性肿瘤的治疗上具有独特的优势，越来越受到医学界的关注与认可。

图3 用 8 μg/mL CTX- 1处理SKOV- 3细胞后流式仪检测细胞凋亡率注：A SKOV- 3细胞的凋亡率；B 不同时间凋亡率的统计结果，与对照组比较， * P<0.01

CTX是眼镜蛇毒中有溶细胞作用的活性多肽，耐热性好、生物活性多样，研究发现其对黑色素瘤、白血病、中枢神经系统肿瘤、胃癌、软骨肉瘤和鼻咽癌等具有溶细胞毒性[11]。CTX- 1能诱导人乳腺癌细胞MCF- 7、人白血病细胞K562、肝癌细胞H22、白血病细胞P388凋亡[12]。且CTX抑制肿瘤细胞增殖有一定选择性，其抑制肿瘤细胞增殖效果明显高于对正常细胞的抑制，如其对恶性T淋巴细胞的IC50 明显小于正常T淋巴细胞[13]。还可抑制人口腔上皮癌细胞增殖迁移，诱导人白血病细胞凋亡[14]。为了研究CTX- 1抗卵巢癌的作用，发掘其作为新的抗卵巢癌药物的潜在价值，我们以人卵巢癌SKOV- 3细胞作为研究对象，发现用4～12 μg/mL浓度CTX- 1处理SKOV- 3细胞，可显著降低细胞活性、抑制其增殖。形态上可以观察到细胞核染色质呈固缩碎裂、形态不均一、染色不均匀等凋亡细胞核形态，随着药物作用时间延长凋亡率增加，8 μg/mL CTX- 1处理细胞6 h细胞坏死率为(1.90±0.27)%，晚期凋亡率为(10.96±1.56)%，而早期凋亡率为(1.52±0.39)%；12 h细胞坏死率为(10.62±0.96)%，晚期凋亡率为(15.07±1.23)%，而早期凋亡率为(1.88±0.17)%，与对照组相比，差异有统计学意义(P<0.01)，说明其对SKOV- 3细胞的抑制作用，主要引起细胞晚期凋亡和坏死。该实验结果与吴敏燕等人发现CTX- 1主要引起细胞晚期凋亡和坏死,发挥其抗肿瘤作用结果一致[7]。

综上所述，CTX- 1可以降低SKOV- 3细胞活力，抑制其在体外的增殖能力，诱导其发生晚期凋亡和坏死。我们在体外细胞实验初步探讨了CTX- 1抗卵巢癌的作用，为其成为新型抗卵巢癌临床药物提供了一定的研究基础，具体机制的研究尚在进行中。