朱婷婷 何淑明

1 南方医科大学第二临床医学院(广州 510515)

2 南方医科大学附属小榄医院(中山 528415)

叶酸在体内参与多种生物过程，其介导的一碳代谢与肿瘤密切相关[1]。在对叶酸受体(folic acid receptor，FRα)与子宫内膜癌(endometrial cancer，EC)相关性的前期研究中，我们发现了FRα在EC中过表达，提示叶酸参与了EC的进展过程[2]。 目前学者们对叶酸与EC的相关性研究结果各异，叶酸对EC的作用机制及作用靶点目前尚不明确[3- 5]。本研究拟采用转录组测序、qPCR和western blot等技术，探究叶酸对EC的作用靶点，为了解及阐明叶酸对EC的作用机制提供一定的理论基础。

1 资料与方法

1.1 转录组测序

提取样品总RNA后，用带有Oligo的磁珠富集真核生物mRNA。加入fragmentation buffer将mRNA打断成短片段，以mRNA为模板，用六碱基随机引物(random hexamers)合成第一条cDNA链，加入缓冲液、dNRTPs、RNaseH和DNA polymeraseI合成第二条cDNA链，在经过QiaQuick PCR试剂盒纯化并加缓冲液洗脱之后做末端修复并连接测序接头，然后用琼脂糖凝胶电泳进行片段大小选择。最后进行qPCR扩增，使用建好的测序文库进行测序。将测序产生的数据mapping到参考基因上，获得基因组上各个基因的表达信息。对比后利用edgeR软件分析基因在样本中的差异表达，计算出差异基因的Pvalue和FDR。

1.2 qPCR

引物设计β-actin(F：5′-TGGCACCAGCACAATGAA-3′， R：5′-CTAAGTCATAGTCCGCCTAG-AAGCA-3′)，TRIB3(F：5′-GCCTTTTTCACTCG-GACCCA-3′，R：5′-GCTT-CTTCCTCTCACGGTCA-3′)，INHBE(F：5′-TCTA GTGGCTTGAGGGGTGA-3′，R：5′-GTGTCCTGCTGTGTCCAAGA-3′)，NRBP2-F2(F：5′-TCAATACCACCATTGCTG-CAC-3′,R：5′-TCAGAGTAGGAGCCTGCATT-3′)(广州辉园苑医药科技有限公司)。用高纯总RNA快速提取试剂盒(BIOTEKE)提取总RNA。RT-PCR(严格按使用说明书进行)。依次在PCR反应管中加入以下反应体系：ddH2O、SYBR、cDNA、引物，于荧光qPCR仪(博日)上进行qPCR反应。以DL 2000DNA marker(TAKARA)标记，进行跑胶验证。

1.3 Western blot

配置裂解混合液(碧云天)提取细胞蛋白，用BAC蛋白定量试剂盒(pierce)测定含量。加入蛋白上样缓冲液(谷歌生物)进行蛋白上样。加入制备好的SDS-PAGE胶(BIOSHARP sigma)进行蛋白样本电泳。在电转槽中电转(250mA，100min)。封闭液封闭PVDF膜，加入一抗工作液及二抗工作液进行免疫反应,用ECL试剂显影。以GAPDH antibody(proteintech)为内参检测NRBP2蛋白表达。

1.4 统计学分析

数据采用SPSS 22.0软件分析，两两比较采用独立样本t检验。生存分析使用Kaplan-meier法和Log Rank检验，P<0.05表示与对照组相比差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 通过转录组测序在子宫内膜癌细胞中找到36个差异基因

上调基因筛选条件：Log21.3≥0.378 585 112，筛选出18个上调基因(见表1)，下调基因筛选条件Log20.5≤0.514 57，筛选出18个下调基因(见表2)。

表1 转录组测序筛选的上调基因

表2 转录组测序筛选的下调基因

2.2 FMN1，TRIB3,INHBE和NRBP2对子宫内膜癌具有生存意义

通过Kplan-Meier分析及long rank检验，筛选出对子宫内膜癌具有生存意义的基因FMN1，TRIB3,INHBE和NRBP2。生存曲线提示FMN1高表达的子宫内膜癌患者生存率高于低表达患者(P=0.021)(见图A)。TRIB3高表达的子宫内膜癌患者生存率低于低表达患者(P=0.020)(见图B)。INHBE高表达的子宫内膜癌患者生存率低于低表达患者(P=0.015)(见图C)。NRBP2高表达患者生存率低于低表达患者(P=0.003 8)(见图D)。

图1 FMN1(A)、TRIB3(B)、INHBE(C)、NRBP2(D)基因的生存曲线

2.3 叶酸作用下子宫内膜癌细胞的INHBE和NRBP2mRNA的表达下调

通过qPCR检测叶酸作用下TRIB3,INHBE和NRBP2 mRNA在子宫内膜癌细胞中的表达(见图2)。对照组(JEC)与实验组(JEC+叶酸)中TRIB3mRNA表达量无统计学差异(P=0.870)(见表3)。与对照组(JEC)相比，实验组(JEC+叶酸)中INHBE的mRNA表达量下降(P=0.020)(见表3)。与对照组(JEC)相比，实验组(JEC+叶酸)细胞中NRBP2的mRNA表达量明显下降(P=0.009)(见表3)。

2.4 叶酸作用下子宫内膜癌细胞的NRBP2蛋白表达下调

以GAPDH为内参，研究通过western blot检测叶酸作用下NRBP2基因在子宫内膜癌中的表达(见图3)。结果发现与对照组(JEC)相比，实验组(JEC+叶酸)中NRBP2的蛋白表达下调(见表4)。

图2 为qPCR产物电泳图1.DL2000；2.JEC，β-actin；3.JEC+叶酸，βactin；4.JEC，TRIB3；5.JEC+叶酸，TRIB3；6.JEC，INHBE；7.JEC+叶酸，INHBE；8.JEC，NRBP2；9.JEC+叶酸，NRBP2

表3 TRIB3,INHBE和NRBP2 mRNA表达统计表

续表

图3 NRBP2蛋白电泳图

表4 IOD值测定

3 讨 论

子宫内膜癌是女性生殖系统最常见恶性肿瘤，发病率不断增加，其确切发病机制未明，目前缺乏有效针对EC的靶向治疗方法。叶酸是DNA合成和细胞生长的必需物质，摄取过量或缺乏均与肿瘤相关。本研究通过转录组测序发现叶酸作用下EC细胞中的36个差异基因，通过生存分析发现FMN1、INHBE、TRIB3和NRBP2基因的表达对EC具有生存意义，提示这四个基因可能参与了叶酸对EC作用的过程，可能是EC的作用靶标。

NRBP2是一种核受体结合蛋白，研究表明NRBP2与细胞成瘤性和细胞凋亡相关[6]，提示NRBP2可能参与了肿瘤进展过程。目前关于NRBP2与EC的研究较少，本研究的生存分析发现NRBP2高表达的EC患者生存率低于低表达患者，提示NRBP2可能是EC中的一个促癌基因，与EC的预后相关，可能是EC的一个预后相关指标。我们通过qPCR和western-blot验证了叶酸作用下EC中NRBP2的表达下调，由于叶酸介导的一碳单位与肿瘤相关，提示叶酸可能通过下调NRBP2表达影响EC的进展，NRBP2可能是叶酸对EC的作用靶标。NRBP2的下调对EC的作用有待深入研究。

抑制素βE(INHBE)是抑制素的一个亚基，研究发现INHBE可能参与子宫内膜的恶性转化[7]，提示INHBE可能参与肿瘤进展过程。本研究的生存分析发现INHBE可能是EC的一个促癌基因，与EC的预后相关。通过qPCR验证叶酸作用下INHBEmRNA表达下调，提示叶酸可能下调EC中INHBE的表达。有研究发现干扰素上调EC细胞中抑制素βE并且发挥凋亡作用[8]。叶酸对INHBE的下调作用可能与EC细胞的凋亡和肿瘤进展相关，INHBE可能是EC的靶标。

TRIB3是一种假激酶，与多种肿瘤进展和预后相关。研究发现TRIB3在EC的表达水平高于正常子宫内膜组织，其过表达促进EC细胞凋亡，并通过调节AKT信号通路抑制其增殖、迁移和侵袭作用[9]，提示TRIB3可能参与EC的进展过程，TRIB3可能是EC的治疗靶标。本研究生存分析发现TRIB3可能是促癌基因，然而，通过qPCR发现叶酸作用下TRIB3mRNA表达无明显变化，提示叶酸可能并不直接影响TRIB3表达。由于样本限制，叶酸对TRIB3的调节作用仍需进一步加大样本验证。

本研究通过转录组测序、生存分析、qPCR和western blot发现在EC中叶酸下调NRBP2的表达，NRBP2可能是EC的一个治疗靶标。INHBE与TRIB3在EC中能否作为潜在治疗靶标需进一步后续验证，NRBP2、INHBE和TRIB3基因对EC的作用有待深入研究。本研究丰富了EC的分子研究，并为EC找到一个新型的作用靶标，可能为EC的诊断和治疗提供一条新的思路。