许蕙，陈昶，王彦生

（沈阳医学院附属中心医院 手外科，辽宁 沈阳 110024）

骨肉瘤是最常见的骨原发恶性肿瘤。好发部位为股骨远端和胫骨近端，其次为肱骨近端[1-2]。目前随着手术和多种药物联合的新辅助化疗的应用，骨肉瘤患者5 年生存率提高到了60%～75%，然而仍有30%～40%的患者发生肺转移和复发，5 年生存率仅为20%[3-4]。随着分子生物学的不断发展，研究发现Livin 参与细胞的多种生理学过程，通过影响细胞增殖和细胞周期控制细胞凋亡[5-6]。Livin 与多种肿瘤发展和患者的预后关系密切，如肾上腺皮质肿瘤、膀胱癌、结肠直肠癌等[7]。目前Livin 在其他肿瘤中的研究较多，而在骨肉瘤中的研究相对较少。Bcl-2家族是细胞生存和凋亡信号的重要整合因子，Bcl-2与肿瘤的发生、发展以及其产生耐药关系密切[8]。本次研究采用免疫组织化学法（SP 法）检测骨肉瘤组织中Bcl-2 蛋白和Livin 蛋白的表达情况，并探究它们的表达与骨肉瘤各临床病理参数是否有关联，进一步探究两者的相关性，为骨肉瘤的临床诊断和治疗提供一些新的思路。

1 资料与方法

1.1 病例收集

收集沈阳医学院附属中心医院与辽宁省肿瘤医院近20 年的骨肉瘤组织蜡块45 例作为实验组，骨软骨瘤45 例作为对照组。实验组：女11 例，男34例；年龄 14～75 岁；平均 23 岁（＜23 岁者 21 例，≥23 岁者 24 例）；病理学分型：骨母细胞型 28 例，软骨母细胞型10 例，纤维母细胞型4 例，其他型3 例；肿瘤部位：股骨27 例，胫骨11 例，肱骨4 例，其他部位 3 例；Enneking 分期：Ⅰ+ⅡA 期 7 例，ⅡB+Ⅲ期38 例；按病理分级：高分化9 例，中低分化36 例。对照组：女 8 例，男 39 例；年龄 17～73 岁；平均 22 岁（＜23 岁 24 例，≥23 岁 21 例）。

纳入标准：⑴病理活检确诊为骨肉瘤，病理及临床资料保存完整；⑵术前未接受放化疗。

排除标准：⑴术前接受过放化疗；⑵病理及临床资料不完整。

1.2 免疫组化实验

试剂：一抗：Livin（武汉谷歌生物科技有限公司），工作浓度为 1∶200；一抗：Bcl-2（武汉谷歌生物科技有限公司），工作浓度为1∶700。二抗：HRP标记山羊抗兔鼠通用二抗（Servicebio），组化试剂盒：DAB 显色剂（Servicebio）。

实验方法：⑴烤片：在60℃烤箱内烤片4 h；⑵石蜡切片脱蜡至水；⑶30%H2O2稀释为3%，室温孵育10 min，蒸馏水冲洗3 次；⑷原修复；⑸凉水中冷却10 min，水洗 1 次；⑹PBS 液浸泡 3 次，每次 3 min。⑺10%山羊血清（PBS 液稀释）封闭，室温 10 min；⑻加入一抗；⑼室温放置20 min，PBS 液冲洗3 次（每次5 min）；⑽滴加适量二抗工作液，37℃孵育30 min；⑾加显色剂DAB 显色（5 min）；⑿蒸馏水充分冲洗；⒀复染；⒁蒸馏水充分冲洗至无明显紫（红）色；⒂脱色；⒃脱水；⒄拿出晾干，中性树脂加盖玻片，自然晾干后镜下观察，图像采集。

1.3 结果阅片判定

细胞染色标准：细胞内出现棕黄色染色。切片均在400 倍镜下选5 个视野，利用Image-Pro Plus 6.0 图像分析系统分析。阳性判断采用 Sinicroper改良法：记录切片中阳性细胞的百分数。阳性细胞计数所占比例评分：阳性细胞数＜5%为0 分；阳性细胞数 5%～25%为 1 分；阳性细胞数 25%～50%为 2 分；阳性细胞数50%～75%为3 分；阳性细胞数＞75%为4分。染色强度分为4 级：不显色为0 分；浅黄色为1分；棕黄色为2 分；深棕色为3 分。切片记分＝阳性细胞百分数×染色强度分数。结果判定：切片计分小于 1 分为阴性（-），切片计分1～3 分为弱阳性（＋），切片计分4～5 分为中度阳性（＋＋），切片计分＞5 分为强阳性（＋＋＋）[9]。

1.4 统计学处理

Livin 和Bcl-2 在骨肉瘤和骨软骨瘤中的表达差异，及Livin 、Bcl-2 在骨肉瘤各临床病理参数中的表达差异采用χ2检验，Livin 和Bcl-2 之间的关系采用相关性分析。本研究所有统计数据均使用SPSS19.0 统计学软件处理，以 P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 Livin 在骨肉瘤和骨软骨瘤中免疫组化结果

Livin 主要表达于细胞浆。阳性表达呈棕黄色（图1），阴性表达为蓝色（图2）。45 例骨肉瘤中30例表达阳性，15 例表达阴性，阳性表达率为66.7%（图5）；45 例骨软骨瘤中0 例表达阳性，阳性表达率为0%。在骨肉瘤组中Livin 蛋白的阳性率显著高于骨软骨瘤组，差异具有统计学意义（χ2=45.00，P＜0.01）。

图2 骨肉瘤中Livin 的阴性表达（HE×400）

图3 骨软骨瘤中Livin 的阴性表达（HE×200）

图4 骨软骨瘤中Livin 的阴性表达（HE×400）

图5 骨肉瘤中Livin 的表达情况

2.2 Bcl-2 在骨肉瘤和骨软骨瘤中免疫组化结果

Bcl-2 主要表达于细胞浆。阳性表达呈棕黄色（图6），阴性表达为蓝色（图7）。45 例骨肉瘤中28 例阳性，17 例阴性，阳性表达率为 62.2%（图 10）；45 例骨软骨瘤中1 例表达阳性，阳性表达率为2.2%。Bcl-2 在骨肉瘤组中的阳性表达率明显高于骨软骨瘤组，两者差异具有统计学意义（χ2=39.2.00，P＜0.01）。

图6 骨肉瘤中Bcl-2 的阳性表达（HE×400）

图7 骨肉瘤中Bcl-2 的阴性表达（HE×400）

图8 骨软骨瘤中Bcl-2 的阴性表达（HE×200）

图9 骨软骨瘤中Bcl-2 的阴性表达（HE×400）

图10 骨肉瘤中Bcl-2 的表达情况

2.3 骨肉瘤组织中Livin 表达与各临床病理参数之间的关系

在不同性别、年龄、肿瘤部位及病理分型的骨肉瘤切片中Livin 的表达差异无统计学意义 (P＞0.05)，在不同病理分级(高分化、中低分化) 中的表达差异有统计学意义（χ2=12.656，P＜0.010），在不同Ennking 分期(Ⅰ+ⅡA，ⅡB+Ⅲ期)中的表达差异有统计学意义（χ2=7.634，P＜0.013）（表 1，图 11）。

2.4 骨肉瘤组织中Bcl-2 的表达与各临床病理参数之间的关系

图11 Livin 在不同Ennking 分期、不同病理分级中的表达情况

表1 骨肉瘤组织中Livin 蛋白表达与各临床病理参数之间的关系

不同性别、年龄、肿瘤部位及病理分型的切片中Bcl-2 的表达差异无统计学意义(P＞0.05)；在不同病理分级(高分化、中低分化) 中的Bcl-2 表达差异有 统 计 学 意 义 （χ2=5.678，P=0.017）；在 不 同Ennking 分期(Ⅰ+ⅡA，ⅡB+Ⅲ期)中 Bcl-2 的表达差异有统计学意义（χ2=5.869，P=0.015）（表 2，图 12）。

2.5 骨肉瘤组织中LIVIN 表达与BCL-2 之间关系

根据统计结果显示：实验组30 例Livin 蛋白表达阳性的切片中24 例Bcl-2 表达阳性，6 例Bcl-2表达阴性，15 例Livin 蛋白表达阴性的切片中4 例Bcl-2 表达阳性，11 例 Bcl-2 表达阴性；28 例 Bcl-2蛋白表达阳性的切片中24 例Livin 蛋白表达阳性，4 例表达阴性，17 例Bcl-2 蛋白表达阴性切片中6例 Livin 蛋白表达阳性，11 例表达阴性。经Spearman 等级相关分析Livin 与Bcl-2 表达呈正相关（r=0.519，P＜0.01）（表 3，图 13）。

3 讨论

图12 Bcl-2 在不同Encking 分期、不同病理分级中的表达情况

表2 骨肉瘤组织中Bcl-2 蛋白表达与各临床病理参数之间关系

表3 骨肉瘤组织中Livin 和Bcl-2 表达的相关性分析

图13 Livin 表达与Bcl-2 表达的关系

骨肉瘤是一种起源于成骨间叶细胞的恶性肿瘤，好发于青少年，是最常见的骨原发性恶性肿瘤[1]。其病程短，进展快，易早期转移，严重威胁青少年的健康。虽然随着多药物联合化疗的应用，患者的生存率得到了明显的改善，但仍有相当一部分患者发生肺转移和复发，预后较差[8]。而且随着患者生存率的提高和寿命的延长，化疗的副作用和耐药带来的一系列问题变得越来越明显。因此医务工作者们渴望找到一种新的副作用小、疗效确切的治疗方案。

骨肉瘤的具体发生机制目前尚不十分清楚。普遍认为肿瘤的发生和发展是多基因、多因素、多步骤的综合过程。正常细胞周期的破坏、细胞凋亡受到抑制、肿瘤细胞增殖是肿瘤发展的重要因素。在这个过程中IAP 家族和Bcl-2 家族发挥着重要的作用[9]。Livin 是近年新发现的一种具有较强抗凋亡能力的凋亡抑制蛋白，属于IAP 家族。Livin 蛋白只存在于发育过程中的组织和一些肿瘤中，而在大多数正常成人组织中不表达[10]。有研究证实Livn 蛋白能和 caspase3、caspase7、caspase9 前体相互反应产生共沉淀，进而抑制它们的活性，从而起到抑制细胞凋亡的作用[11]。有研究发现 JNK1（Jun 氨基酸末端激酶1）、JNK2（Jun 氨基酸末端激酶2）可以被Livin蛋白选择性的激活，进而抑制TNF-α（肿瘤坏死因子）和ICE(白细胞介素1 转化酶)，达到抑制细胞凋亡的目的。Livin 在多种肿瘤组织中高表达，而在正常组织中低表达或不表达[12]。随着研究的深入，发现Livin 与多种肿瘤的发生、发展及预后关系密切。Livin 在弥漫大B 淋巴细胞瘤中，被证实与弥漫大B淋巴细胞瘤的原发部位、IPI 评分、病理类型等有关，有望成为判断DLBCL 预后的指标[13]。Bcl 家族是细胞生存和凋亡信号的重要整合因子，该家族分为三大类：抗凋亡成员：Bcl-2、Bcl-x 等，抑制细胞凋亡[14]；促凋亡成员：Bax、Bak 等；以及 BH3-only 死亡蛋白。抗凋亡成员和促凋亡成员间相互作用设定了细胞死亡的阈值[11，15]。

本次研究中Livin 和Bcl-2 在骨肉瘤组中的阳性表达率均明显高于骨软骨瘤组，说明Livin 和Bcl-2 可能与骨肉瘤的发生和发展有密切关系。Ennking 分期ⅡB+Ⅲ期中Livin 的阳性率明显高于Ⅰ+ⅡA 期，表明骨肉瘤从早期（Ⅰ+ⅡA 期）发展到中晚期（ⅡB+Ⅲ期）过程中Livin 可能扮演了重要角色，如果我们在肿瘤早期及时使用靶向治疗药物沉默Livin 基因，抑制其表达，可能延缓甚至阻止肿瘤继续发展。病理分级中、低分化组中Livin 的阳性率明显高于高分化组，提示骨肉瘤组织病理分化程度越低Livin 的表达阳性率越高，表明Livin 能提示骨肉瘤的病理分化程度。经统计学分析在骨肉瘤中Livin 的表达与Bcl-2 的表达呈正相关关系，两者在骨肉瘤中可能有协同作用。

综上所述，Livin 是新发现的凋亡抑制蛋白，在多种肿瘤中特异表达，参与多个抑制细胞凋亡的途径，相对其他IAP 成员Livin 具有重要的地位。Bcl-2 在肿瘤细胞的发生、发展及预后中具有重要作用。联合研究Livin 和Bcl-2 与骨肉瘤组织的关系，及两者间的关系，必将为骨肉瘤的诊断、治疗带来新的思路和方法。

本实验说明了Livin 与Bcl-2 在骨肉瘤细胞中高表达，与骨肉瘤的Ennking 分期及病理分级程度相关。在骨肉瘤中Livin 的表达与Bcl-2 呈正相关关系。检测Livin 和Bcl-2 有可能对骨肉瘤的诊断和预后判断有所帮助。Livin 极可能成为骨肉瘤基因靶向治疗的新位点。