杨红 张威 安太健 王庆峰

摘要：目的  采用網络药理学方法探讨葛酮通络胶囊缓解缺血性脑卒中（ICA）的机制。方法  依托DisGeNET数据库构建ICA背景网络，通过中药系统药理学数据库和分析平台（TCMSP）及TCM Database检索葛根中的黄酮类化合物，获得其相应靶点，并对ICA进行打靶处理，获得作用靶点，进而构建蛋白质相互作用网络及化合物-靶点-通路网络，据此分析葛酮通络胶囊缓解ICA的机制。结果  获得葛根黄酮化合物9个，其对应靶点321个，ICA靶点共393个。葛根的黄酮化合物共有48个为其药物作用的直接靶点，平均节点度为30.8，核心蛋白相互作用网络中22个靶点的节点度大于平均节点度。葛酮通络胶囊改善ICA的主要KEGG通路为血液流体及动脉粥样硬化、核因子-κB、肿瘤坏死因子等，并广泛参与调节血液代谢如调节血压、调节脂代谢过程、调节细胞凋亡等生物过程。结论  本研究初步验证了葛酮通络胶囊缓解ICA的靶点及作用方式，可为进一步揭示其作用机制奠定基础。

关键词：葛酮通络胶囊;缺血性脑卒中;网络药理学;分子靶点;作用机制

中图分类号：R277.733;R2-05    文献标识码：A    文章编号：1005-5304（2019）12-0084-06

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2019.12.018  开放科学（资源服务）标识码（OSID）：

Discussion on Mechanism of Getong Tongluo Capsules in Relieving Ischemic Stroke Based on Network Pharmacology

YANG Hong¹， ZHANG Wei¹， AN Taijian¹， WANG Qingfeng²

1. Affiliated Hospital of Liaoning University of Traditional Chinese Medicine， Shenyang 110032， China; 2. Liaoning University of Traditional Chinese Medicine， Shenyang 110032， China

Abstract： Objective To explore the mechanism of Getong Tongluo Capsules in relieving ischemic stroke （ICA） through network pharmacology. Methods The background network of ICA was constructed based on DisGeNET database， and the flavonoids in Puerariae Lobatae Radix were retrieved by TCMSP and TCM database to obtain their corresponding targets. The ICA were targeted with the above targets， and the target of its action was obtained， and then a protein interaction network and a compound-target-path network were constructed. Finally， the mechanism of Getong Tongluo Capsules in alleviating ICA was analyzed. Results There were 9 flavonoids in Puerariae Lobatae Radix， with 321 corresponding targets， and 393 ICA targets. There were 48 flavonoids in Puerariae Lobatae Radix as the direct targets of drug action， with an average node degree of 30.8， while 22 targets were larger than the average node degree in the core PPI network. The main KEGG pathways of Getong Tongluo Capsules in improving ICA symptoms were blood fluids and atherosclerosis， NF-κB and TNF. Getong Tongluo Capsules were more widely involved in regulating blood metabolism， such as blood pressure regulation， lipid metabolism and apoptosis. Conclusion The results of this study preliminarily validate the target and mode of Getong Tongluo Capsules in alleviating ICA， and lay a foundation for further revealing its mechanism of action.

Keywords：Getong TongluoCapsules; ischemic stroke; network pharmacology; molecular targets; mechanism of action

缺血性脑卒中（ischemic cerebralvascular accident，ICA）是临床常见的急性脑血管疾病。在ICA治疗过程中，除溶栓、抗凝及神经保护等药物外，还可联用中药^[1-2]。已有研究表明，葛酮通络胶囊用于治疗脑卒中疗效良好^[3-5]。葛酮通络胶囊主要成分为葛根总黄酮，功效活血化瘀，用于缺血性中风中经络恢复期瘀血痹阻脉络证，症见半身不遂、口舌歪斜、偏身麻木、语言不利、头晕目眩、颈项强痛等。目前针对葛酮通络胶囊的研究多集中于临床，其机制研究相对较少。本研究采用网络药理学方法，构建中药成分-靶标-信号通路复杂网络，分析葛酮通络胶囊有效成分作用于ICA的主要靶点，以期阐明其分子调控机制。

1  资料与方法

1.1  药物有效成分筛选

葛酮通络胶囊的主要成分为葛根总黄酮提取物。通过检索中药系统药理学数据库与分析平台（TCMSP，http：//lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php），得到葛根的已知化合物，获取其中的黄酮类化合物，即为葛酮通络胶囊的有效成分。

1.2  口服生物利用度预测

口服生物利用度（OB）指药物在人体循环系统的吸收情况，并以吸收、分布、代谢、排泄（ADME）药代动力学参数评价药物的口服吸收活性。本研究根据TCMSP中的OBioavail模型^[7]评价药物的吸收特性，并基于此获得葛酮通络胶囊黄酮类成分的OB值。

1.3  药物有效成分和疾病靶点收集

在Drugbank数据库（http：//www.drugbank.ca）中找出葛酮通络胶囊有效成分所作用的分子靶点。检索DisGeNET数据库（http：//www.disgenet.org），以“Ischemic Cerebrovascular Accident”（№.C0948008）为关键词，获得ICA调控的分子靶点。以String构建上述分子靶点对应的网络数据库。

1.4  网络构建与分析

采用Cytoscape3.7.1软件，以ICA的String数据为基础，构建ICA调控的蛋白质相互作用网络，再以葛酮通络胶囊有效成分作用的分子靶点对该网络进行打靶处理，获得其对应的直接调控靶点及其所涉及的相关调控网络。通过Cytoscape3.7.1软件网络分析功能对该网络进行拓扑学运算，获得该药物-靶标网络的分布特性。为确定葛酮通络胶囊有效成分对目标蛋白质相互作用网络的调控作用，以药物与疾病重叠靶点的String数据为基础构建背景网络，再引入药物的化合物-靶点网络，获得化合物-蛋白质相互作用网络。采用Cytoscape3.7.1软件cluster maker2插件对网络特性进行聚类分析，采用其clueGO插件对关键分子靶点的基因功能（GO）和相关通路进行富集分析。

2  方法与结果

2.1  药物有效成分及其靶点

从TCMSP共获取葛根的已知化合物18种，其中黄酮类化合物共9种，其OB值为11.52%～69.67%，类药指数（DL）为0.19～0.78，见表1。在Drugbank数据库中找出9个有效成分所作用的分子靶点共321个，经降重处理，获得葛酮通络胶囊有效成分作用的分子靶點共190个。

2.2  药物-疾病作用网络构建与分析

通过DisGeNET数据库获得ICA调控的分子靶点共393个（Summary模式）。以葛酮通络胶囊作用的分子靶点对ICA调控的蛋白质相互作用网络进行打靶，获得重叠的分子靶点共48个。

进一步根据ICA蛋白质相互作用网络特征，获得与直接靶点调控较为密切的间接靶点，所得网络形态见图1。根据该网络的拓扑结构可知，网络内的节点共311个，对应的边共4755条，平均节点度为30.8，共有113个节点大于平均节点度。

以48个直接靶点对葛酮通络胶囊的化合物-分子靶点背景网络进行打靶处理，获得药物的化合物-靶点网络，见图2。

可以看出，在已获得的9个黄酮类化合物中，大豆苷-4，7-二葡糖苷（daidzein-4，7- diglucoside）无法直接对ICA的相关网络进行调控，故后续研究及网络构建中不引入大豆苷-4，7-二葡糖苷所涉及的调控靶点分子。

葛酮通络胶囊有效成分对目标蛋白相互作用网络聚类分析结果见图3。

对该网络的拓扑结构（剔除化合物节点）分析可知，网络节点共311个，对应530条边，平均节点度为19.32。该网络可以确定为葛酮通络胶囊缓解ICA的核心蛋白相互作用网络。对图3靶点分子的节点度进行排序，结果见图4。48个靶点中，大于平均节点度的靶点共22个，分别为IL6、PTGS2、VEGFA、NOS3、PPARG、MMP9、TP53、CXCL8、IL1B、ESR1、ICAM1、VCAM1、MMP2、MAPK1、IGF1、KDR、F2、IL4、TGFB1、AGTR1、AR和SELP。可确定上述分子靶点是葛酮通络胶囊缓解ICA的核心调控分子。

2.3  基于药物作用靶点的功能预测

为进一步考察葛酮通络胶囊缓解ICA的作用方式及效果，对获得的22个关键分子靶点功能进行分析。经clueGO插件分析，获得葛酮通络胶囊的富集功能，见图5、图6。去除其中与ICA无关的通路（如胶质瘤、黑色素瘤、前列腺癌等），取P≤0.01，获得葛酮通络胶囊缓解ICA的主要KEGG通路，包括血液流体及动脉粥样硬化（Fluid shear stress and atherosclerosis，FssAs）、核因子-κB（NF-κB）、肿瘤坏死因子（TNF）及松弛素（Relaxin）等通路。取P≤0.000 1，获得调控的相关生物过程（GO-BP），其可通过对关键分子靶点的调控，实现对血管平滑肌（regulation of blood vessel endothelial cell migration）、一氧化氮代谢（positive regulation of reactive oxygen species metabolic process）、生成血管内皮生长因子（regulation of vascular endothelial growth factor production）等生物过程的调控。

3  讨论

葛酮通络胶囊于1995年收入《中华人民共和国药典》，但针对该药的研究相对落后，仍然以临床疗效^[8-9]或质量标准^[10-11]为主，而对其机制研究不够深入，极大限制了该药进一步的临床应用。本研究依托TCMSP构建该药的化合物-靶点网络，再应用DisGeNET数据库构建ICA的背景网络，经打靶处理，确定了葛酮通络胶囊的化合物-靶点-疾病靶点的相互作用关系，为考察药物的治疗机制提供参考。

由图2可知，染料木黄酮、大豆苷元和葛根素为整个药物的关键化合物，其节点度远高于其他化合物，可推测上述3个化合物在药物治疗中发挥关键作用。基于染料木黄酮、大豆苷元的OB值及DL值低于葛根素（见表1），可以确定，葛根素是葛酮通络胶囊最重要的有效成分。研究表明，葛根素有良好的抗缺血再灌注的药理活性，可有效改善肾脏、心脏及脑的缺血再灌注症状^[12-14]。另外，大豆苷元^[15]、染料木黄酮^[16]、芒柄花黄素^[17]等也被临床及基础研究显示有较好的改善脑缺血再灌注的药理学活性。因此，葛酮通络胶囊缓解ICA是一个多成分、多靶点、多途径的过程。

由图4可知，葛酮通络胶囊参与了ICA相关大量分子靶点的调控。而这些靶点在ICA的发病过程中介导不同的生物学功能。随着脑缺血发生，小胶质细胞活化，并激活其对应经典激活（M1）及选择激活（M2）表型。其中，M1可激活NFKB通路，该通路上的白细胞介素（IL）-1及基质金属蛋白酶（MMP）-9开始释放，加重脑部损伤^[18];IL-4则随M2的细胞激活而产生，从而抑制炎症反应，保护脑组织^[19]。随着脑部缺血，脑组织内的星形胶质细胞亦会直接释放多种促炎症因子，进而诱导一氧化氮合酶（NOS）过表达，促进反应性胶质增生和胶质瘢痕形成^[20]。除直接调控脑组织的细胞活化外，葛酮通络胶囊的分子靶点还包括细胞黏附分子（ICAM）及趋化因子所涉及的炎症反应。脑部缺血会上调ICAM表达，导致细胞间的黏附，诱导炎症反应;此时，内皮细胞表面的选择素-P及选择素-E会募集血液中白细胞，并通过ICAM1结合于血管内皮表面，再使其分泌的水解酶直接破坏组织损伤区的血管壁^[21]。脑部缺血也会上调趋化因子（CXC）的表达，维持炎症反应及组织损伤区的炎症通路。Villa等^[22]研究显示，通过对IL-8/CXCL8的抑制，脑部损伤面积显著缩小，且脑部的炎症反应随之减轻。ICA可直接改变脑组织的血脑屏障通透性，特别是损伤区域，由于ICAM及CXC的持续炎症作用，血脑屏障的通透性增加会持续长达损伤后7 d，这也开启了大量炎性细胞进入损伤区域的通道。因此，降低血脑屏障通透性可保护ICA带来的脑组织损伤，葛酮通络胶囊可通过对MMP的调控发挥该作用。MMP是肿瘤研究中的关键靶点分子， MMP过表达导致细胞外基质不断降解，增加血脑屏障通透性。以往研究显示，MMP-9随着ICA的发病而过表达，且与脑梗死面积、神经功能缺损程度呈正相关^[23-24]。本研究顯示，除炎症反应外，葛酮通络胶囊还可改善ICA的血管重构，如调控血管内皮生长因子（VEGF）及Relaxin信号通路上的靶点分子诱导内皮型一氧化氮^[25]及VEGFA^[26]等。其生物过程包括：①调控血管平滑肌的增殖过程（IL-6、TSF1）;②调控血管内皮细胞的迁移（TGR、TGFB1）;③调节VEGF的产生（IL-1B、TGFB1）。

根据功能富集结果可知，葛酮通络胶囊主要调控的KEGG通路包括FssAs、炎症反应（如NF-κB和TNF）、Relaxin信号通路等。通过对炎症反应的通路调控，改善ICA所致的血脑屏障破坏、脑水肿等炎症浸润;通过对FssAs、Relaxin通路调控，缓解ICA血管重构所致的脑部缺氧去极化、氧自由基损伤及脑部细胞凋亡。GO-BP富集结果表明，葛酮通络胶囊可有效调节血管平滑肌及氧代谢过程。对葛酮通络胶囊的功能富集分析表明，可有效理清其缓解ICA的主要路径及方式。葛酮通络胶囊通过对靶点的调控，影响其对应的表型/通路，从而缓解ICA。

综上所述，本研究应用网络药理学方法，对葛酮通络胶囊多成分、多靶点、多途径的复杂网状关系进行研究，结果初步验证了葛酮通络胶囊缓解ICA的相关机制，并为进一步深入探讨其作用机制奠定基础。

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（收稿日期：2019-02-18）

（修回日期：2019-03-15;编辑：陈静）