刘满宇 付 璐 张文慧 张林波

(吉林农业大学生命科学学院,长春 130118)

外泌体作为一种功能广泛的胞内囊泡，与免疫细胞的多种功能有着密切联系。但外泌体在免疫细胞间及免疫细胞与其他细胞间如何发挥作用，以及外泌体的作用与机体免疫应答之间存在何种联系，目前尚未完全阐明。探究外泌体对免疫细胞的影响及在免疫过程中的作用，对于进一步揭示免疫系统功能及其运作方式具有重要意义。

1 外泌体的形成机制及主要作用

外泌体(Exosome)是一种由磷脂双分子膜与包裹在膜中的蛋白质、核酸、脂类、糖类等物质构成的囊泡样结构，直径在30～100 nm之间。20世纪80年代首次被发现于羊网织红细胞的培养液中。一般认为，外泌体起源于细胞内的多囊体(Multivesicular body，MVB)，在ESCRT复合物、脂质和四跨膜蛋白超家族等多种分子的参与下成熟，并在RAB蛋白家族的参与下与质膜融合，进而释放到细胞外环境中(图1)，这一融合过程也可能与SNAREs蛋白有关。

图1 细胞内外泌体产生和分泌的机制[1]Fig.1 Mechanism of production and secretion of cell internal and external secretory bodies[1]Note:ESCRT.Endosomal sorting complex required for transport；SNAREs.Soluble NSF-attachment protein receptor.

近年来的研究表明，免疫细胞、肿瘤细胞、干细胞、上皮细胞等细胞均能够产生外泌体。这些外泌体能对巨噬细胞、树突状细胞(Dendritic cell，DC)、T淋巴细胞、B淋巴细胞、自然杀伤细胞(Natural killer cell，NK cell)等免疫细胞进行调控。同时免疫细胞也能产生外泌体参与免疫应答(图2)，发挥抗原递呈、免疫激活、细胞杀伤及调节代谢等众多作用。

图2 外泌体与DC的相互作用[2,3]Fig.2 Interaction between exosome and DC[2,3]Note:A.The stimulatory effect of tumor-derived exosomes to DC；B.The mechanism of DC regulating immune response through exosomes.

2 不同来源外泌体对免疫细胞的作用

目前的研究表明，来自肿瘤细胞、干细胞以及一些受到外源刺激的免疫细胞和组织细胞分泌的外泌体能够靶向刺激免疫细胞， 对免疫系统的功能进行调控。同时，不同免疫细胞之间也会通过外泌体来协调免疫过程，这些外泌体对免疫细胞所引发的免疫调控机制也是免疫应答中的重要组成部分。

2.1外泌体影响巨噬细胞的极化 巨噬细胞作为非特异性免疫的重要组成部分，既是非特异性免疫的执行者，也是免疫信号的重要传递者。一般认为，在不同细胞因子的刺激下，组织内巨噬细胞可极化为M1和M2两种亚群，分别起到介导炎症反应和抑制炎症的作用。随着研究的深入，人们发现外泌体对巨噬细胞的功能调控主要通过控制其极化来实现。而let-7b/tLR 4通路可能是外泌体诱导巨噬细胞极化的重要方式[4]。体外实验发现，来自抗原递呈细胞的外泌体通过携带的脂多糖等抗原物质诱导极化[5]；肿瘤细胞释放的外泌体中则携带有血小板反应素1，能够激活巨噬细胞并使其向M1型极化[6]。小鼠的背根神经节感觉神经元在外周轴突损伤后，会释放miR-21-5p过表达的外泌体，来促进巨噬细胞的M1极化[7]。能够促进巨噬细胞M2极化的外泌体也有许多。人脐带间充质干细胞(Mesenchymal stem cells，MSC)能通过外泌体作用于体外培养的骨髓来源巨噬细胞，诱导其从M1型极化到M2型并下调炎症因子的释放，以利于脊髓损伤后的修复[8]；受到脂多糖刺激的MSC分泌的外泌体对大鼠巨噬细胞的调节作用更为明显，能够促进大鼠的创伤愈合[4]。在小鼠体内肿瘤细胞的上皮间充质转换过程中会释放含有miR-21的外泌体，诱导巨噬细胞的M2极化[9]。此外肿瘤细胞也可以通过GP130/STAT3[10]、PTEN/PI3Kγ[11]等信号通路来促进极化。另外的一些研究表明，小鼠的脂肪干细胞可能通过miR-30D-5P在体内刺激巨噬细胞的M2极化作用[12]。在体外实验中，来自氧化低密度脂蛋白诱导的内皮细胞中的外泌体可利用携带的转移相关肺腺癌转录本1促进M2巨噬细胞极化，这可能与动脉粥样硬化发生有关[13]；暴露在酒精中的单核细胞释放的外泌体利用携带的miR-27a与初始单核细胞沟通，诱导其极化为M2型巨噬细胞[14]。

这些研究表明，促进巨噬细胞向M1型极化的外泌体主要来源于抗原递呈细胞、肿瘤细胞和神经元细胞等。而诱导巨噬细胞向M2方向极化的外泌体可来自MSC、肿瘤细胞、脂肪干细胞、上皮细胞和酒精处理过的单核细胞等。这些外泌体促进极化的作用与其携带的miRNA有着密切的关系。

2.2外泌体对T细胞分化与功能调控的影响 T细胞作为免疫系统的重要组成部分，一方面是免疫信息传递的重要环节，另一方面也能直接发挥免疫杀伤效应。T细胞包括众多亚群，如细胞毒性T细胞(Cytotoxic T-lymphocyte，CTL)、抑制性T细胞(Suppressor T cell，Ts)、调节性T细胞(Regulatory T cell，Treg)和辅助性T细胞(Helper T cell，Th)等。这些亚群分化自T原细胞，其可在外泌体的刺激下分化成相应的功能性T细胞。

研究表明，小鼠体内MSC来源的外泌体能诱导T原细胞向Treg的分化，这一过程依赖抗原呈递细胞的存在[15]；DC来源的外泌体能够刺激T原细胞PI3K/mTOR轴影响其分化，进而控制Treg和Th17细胞的平衡[16]；受到致病菌刺激的上皮细胞也能够通过外泌体促进Th17的增殖，进而促进结肠肿瘤生长[17]。从小鼠肥大细胞培养液中提取的外泌体可增强CD4+T细胞向Th2细胞分化[18]。在癌症患者体内提取的肿瘤细胞中衍生的外泌体能够体外调节T细胞产生细胞因子，并下调活化T细胞中CD3ζ与JAK3的表达，通过Fas/FasL(Fas配体)诱导活化的CD8+T细胞凋亡[19]；也可通过影响Th1和Th17的分化与促进Treg产生来损伤T细胞功能[20]。

外泌体除参与T细胞分化外，也与T细胞功能调控有关。肿瘤细胞与DC来源的外泌体能够介导抗原特异性T细胞活化和免疫活性改变[21]。被肿瘤细胞激活的DC产生的外泌体，能在小鼠体内以MHCⅠ依赖的方式促进CTL活化，使CD8+T细胞分化为CTL效应细胞，产生T细胞依赖性抗肿瘤免疫[22，23]；卵清白蛋白(OVA)特异性T细胞分泌的外泌体能够抑制小鼠体内OVA激活的树突状细胞，刺激CD8+CTL反应，进而抑制抗肿瘤免疫[24]。在一些体外实验中发现，肿瘤细胞来源外泌体还会导致Treg强烈和持续地生成肌苷[25]，并通过调控TGF-β和IL-10表达，来提高Treg的增殖能力，从而增加其对细胞凋亡的抗性[26,27]。Treg能将miRNA转移到Th1中，抑制Th1增殖和细胞因子分泌[28]。此外，肿瘤来源外泌体还能够改变CD4+或CD8+T细胞的炎性因子表达[20]。

从这些研究中我们可以看出，T细胞的分化可受到来自MSC、DC、肿瘤细胞、肥大细胞、上皮细胞等多种来源外泌体的影响。同时，来自肿瘤细胞、DC、Treg和被激活的T细胞能够调控受体T细胞的状态，包括调节细胞活性、CTL反应及改变细胞因子表达等。

2.3外泌体对B细胞状态与功能的影响 作为机体免疫中重要的效应细胞，B细胞的细胞膜表面带有多种类型的受体，在体液免疫过程中，B细胞能够分化为浆细胞，并分泌特异性抗体。有研究显示，外泌体能通过淋巴管迅速地从周边传输到淋巴结，而淋巴结中的B细胞则是外泌体的主要摄取者之一[29]。

在体外共培养条件下，MSC细胞衍生的外泌体能够抑制B细胞的炎症作用，并影响B细胞的分化[30]；骨髓基质细胞来源外泌体也可抑制慢性淋巴细胞白血病B细胞的自发凋亡，并增强其耐药性和迁移能力[31]；而DC来源的外泌体也能够通过补体激活和抗原穿梭的方式参与介导T细胞和B细胞的激活，诱导抗肿瘤免疫[32]。肿瘤细胞来源的外泌体能够通过脂质筏/胆固醇内吞途径来刺激人B细胞[33]，并增强B细胞的增殖与向浆细胞的分化[34]。

而当B细胞受到病毒的侵染时，外泌体还会作为载体，调控B细胞的状态并参与物质运输。如EB病毒感染的B细胞能够被人口腔上皮细胞分泌的富含miR-200家族成员的外泌体触发激活，并促进B细胞与口腔上皮细胞间的病毒交换[35]。

通过这些研究可知，来自MSC、DC、肿瘤细胞、上皮细胞等细胞的外泌体能够改变B细胞的分化、激活、增殖和凋亡，并影响其耐药性和迁移能力。

2.4外泌体对树突状细胞调控和表达的影响 树突状细胞(DC)分为髓样DC和淋巴样DC，是一种功能强大的抗原递呈细胞，与肿瘤的产生和发展有着紧密联系。在这一过程中，外泌体的作用也不容忽视。

小鼠体内的肿瘤细胞能够分泌携带肿瘤抗原、LAMP1、OVA和pMHCⅠ等分子的外泌体，并转移到DC中，引发DC的抗肿瘤免疫[22，36]。而DC的抗肿瘤免疫过程也是通过外泌体实现的。胰腺癌细胞株的体外实验发现肿瘤细胞外泌体能够将miRNA转移到DC中，改变DC的miRNA表达并抑制调节因子X相关蛋白(rFXAP)产生，这可能是导致MHCⅡ分子抑制和免疫耐受的原因[37]；同来源的外泌体也能下调DC中的TLR4和下游细胞因子[38]。

此外，DC也可以接受来自B细胞的外泌体并调控T细胞的分化；T细胞能够利用携带含有基因组或线粒体DNA的外泌体，通过cGAS/STING胞质DNA传感通路与IRF3依赖性干扰素调节基因的表达，诱导DC的抗病毒反应[39]。

以上研究表明，DC能够被来自肿瘤细胞和其他免疫细胞的外泌体调控。这些外泌体能通过传递抗原、miRNA等多种物质，影响DC的增殖、活化以及细胞因子和miRNA的表达。

2.5外泌体对NK细胞肿瘤杀伤作用的影响 自然杀伤细胞(Natural killer cell，NK)是先天免疫细胞，其在机体防御的第一线尤其是肿瘤杀伤过程中起关键作用。而外泌体可显著影响NK细胞杀伤作用。

众多体外实验表明，肿瘤细胞来源外泌体可通过携带的IL-15、IL-18等细胞因子以及4-1BBL蛋白类似物，促进NK细胞的活化与增殖，增强其敏感性与抗肿瘤效力[40，41]；也可携带NF-κB-α激活激酶相关蛋白1(NAP-1)，通过增加NK细胞中干扰素调节因子3(IRF-3)的表达及其磷酸化，来提升Ⅰ型干扰素基因和趋化因子配体基因的表达，促进NK细胞的功能[42]。而这些外泌体携带的TGFβ1，能够下调NK细胞NKG2D受体表达，诱导NK细胞中Smad磷酸化[19]；或利用miR210和miR-23α等miRNA，直接影响NK细胞中CD107a和IFNg的表达，降低其细胞毒性与抗肿瘤活性[43]；肿瘤来源外泌体还能抑制NK细胞活化受体表达，来降低NK细胞的肿瘤杀伤作用[40]。DC则通过分泌表达白细胞介素-15Ra和NKG2D配体的外泌体，直接参与IL-15Ra与NKG2D依赖的NK细胞增殖和活化，促进分泌IFNc[44]。

由此可见，NK细胞能够受到肿瘤细胞和DC来源的外泌体调控。其中肿瘤细胞来源的外泌体能起到双向调控的作用。一方面，这些外泌体能够激活NK细胞，促进其增殖，并提高对肿瘤细胞的杀伤；另一方面，也可通过抑制细胞毒性而逃避免疫监视。而DC来源的外泌体主要对NK细胞起到激活作用，并促进NK细胞的增殖。

3 免疫细胞来源外泌体对其他细胞的功能

外泌体除了能调控免疫细胞功能外，还是免疫细胞功能调控的执行者。免疫细胞来源的外泌体能够调控包括免疫细胞、上皮细胞、肿瘤细胞等多种受体细胞并改变微环境。进而对整个免疫应答造成影响。

3.1巨噬细胞来源外泌体在机体免疫应答及调控过程中的作用 作为非特异性免疫的重要效应细胞和抗原呈递细胞，巨噬细胞也可利用外泌体释放信号。这些信号随着其所在微环境和受到刺激的不同而改变，当受到结核分枝杆菌、沙门氏菌、弓形虫、艾滋病毒等病原体的感染和一些外来抗原的刺激时，巨噬细胞释放的外泌体能携带病原体相关的分子模式受体(PAMPs)[45]，同时会导致外泌体中miRNA的种类与含量发生变化[46]。

一些体外实验表明，从鼠伤寒沙门氏菌感染的巨噬细胞中分泌的促炎外泌体能触发幼稚巨噬细胞和DC Toll样受体4依赖性的TNF-α释放，以及其他多种细胞因子的分泌，这可能与外泌体中包含的LPS有关[47]；而LPS对巨噬细胞的激活也能通过影响其释放的外泌体中miRNA与蛋白表达，引起脂肪细胞基因表达的改变。这些变化与补体活化、活性氧种类调节、白细胞迁移与活化、单核细胞趋化等炎症反应有关，也对碳水化合物的分解代谢和细胞活化产生影响[48]。同时在利用病原菌感染小鼠的研究中发现，有的病原菌如结核分枝杆菌,其感染的巨噬细胞能够通过外泌体的途径呈递抗原，并能协同ATP促进MHC-Ⅱ的释放，通过外泌体向T细胞表达抗原肽，这在促进T细胞免疫的过程中起重要作用[49，50]；而在病原体的刺激下，巨噬细胞产生的外泌体能够促进TNF-α和IL-12的产生以及中性粒细胞和巨噬细胞的募集，这可能是免疫激活的一部分[45]。

关于巨噬细胞来源外泌体对上皮细胞的影响，体外实验结果表明，巨噬细胞释放的外泌体能够刺激内皮细胞中的整合素向溶酶体转运，诱导整合素蛋白降解，进而对内皮细胞的迁移起到负调节作用[51]；在LPS诱导的脓毒性肺损伤小鼠模型中，被LPS激活的巨噬细胞释放的外泌体中，促炎性miRNA(miRNA-155、miRNA-146a)表达上调，使上皮细胞中的促炎介质TNF-α与IL-6表达增加，进而破坏支气管上皮细胞紧密连接蛋白的表达，对肺部的结构屏障造成破坏[52]。有研究者尝试在体外将巨噬细胞来源的外泌体作为载体承载miRNA抑制剂，发现其能够调控肿瘤细胞中的miRNA表达水平[53]。这可能会成为肿瘤治疗的一种新方式。

以上结果表明，巨噬细胞来源的外泌体能作用于其他免疫细胞、脂肪细胞、上皮细胞与肿瘤细胞，发挥着抗原呈递、免疫调节及代谢调控等作用。

3.2T细胞来源外泌体的肿瘤杀伤及免疫激活作用 在T细胞中，外泌体的释放受到二酰基甘油和二酰基甘油激酶(Diacylglycerol kinase α，DGKα)的调节，DGKα能够调控PKD1/2的亚细胞定位与激活，PKD1/2是外泌体分泌的关键调节分子，介导DGKα对外泌体分泌通道的影响[39]。而这些外泌体在体外能够发挥多种作用。

大鼠体内OVA抗原特异性的T细胞外泌体能够抑制DC对CD8+T细胞的刺激，进而抑制DC介导的大鼠CD8+CTL糖尿病和抗肿瘤免疫[24]。而在小鼠体内，Treg来源的外泌体还能将miRNA转移到Th1细胞中，抑制Th1细胞增殖和细胞因子分泌[28]。体外实验表明，CTL能通过外泌体来释放TNF超家族，诱导肿瘤细胞死亡[54]。在脾和淋巴结部位衍生的Ts则能分泌抑制性外泌体，调节免疫炎症反应外周组织部位抗原递呈细胞和效应T细胞功能[55]。受到LPS刺激的Treg衍生的外泌体能携带miR1505p和miR-142-3p调控DC，使IL-10过表达并抑制IL-6表达来抑制免疫反应，这可能有助于治疗自身免疫性疾病[56]。而在受到腺病毒基因刺激时，Treg会分泌含有独特的miRNAs和iNOS分子的外泌体。其能诱导细胞凋亡，并促进T细胞向Treg的转化[57]。

通过这些研究可知，T细胞来源外泌体能够作用于DC、肿瘤细胞、抗原递呈细胞和其他T细胞，其功能包括激活T淋巴细胞介导的细胞毒性和杀伤作用以及多种免疫调节过程。

3.3B细胞来源外泌体对免疫细胞的作用 与T细胞类似，在B细胞内MVB成熟和外泌体分泌的过程中，PKD1/2蛋白扮演着关键调节因子的角色[58]，能够影响细胞功能并造成微环境的改变。

体外研究表明，这些外泌体能够传递miRNA-155来抑制肝细胞中丙肝病毒的活性[59]，还能携带过敏原衍生肽以诱导T细胞增殖和Th2样细胞因子的产生[60]。而一些病毒对B细胞的感染也会改变其外泌体成分与功能，使之对细胞代谢产生影响，进而改变肿瘤微环境[61]。同时，B细胞外泌体能在小鼠体内激活特异性T淋巴细胞、诱导体内的细胞毒性反应[62]。

B细胞淋巴瘤是一组淋巴组织的恶性肿瘤，其特征为B淋巴细胞的恶性转化。B细胞淋巴瘤细胞来源的外泌体在肿瘤发生过程中起双重作用。一方面，来自肿瘤细胞的外泌体能将肿瘤抗原和MHCⅠ类分子传递给树突状细胞，然后通过诱导CD8+T细胞依赖性的抗肿瘤免疫应答，直接抑制恶性肿瘤的发生[63]；而另一方面也能诱导免疫细胞的凋亡，并通过抑制NKG2D受体介导的细胞毒性，从而损害NK细胞功能[64]。对外泌体在B细胞淋巴瘤中的作用研究，为淋巴瘤的抑制和治疗提供了新思路。

通过对这些研究的总结可知，来自B细胞的外泌体可以作用于肝细胞、T细胞、DC及NK细胞，影响细胞的激活、代谢与凋亡。

3.4树突状细胞来源的外泌体及其功能 DC来源的外泌体主要通过激活其他免疫细胞来发挥功能，作为免疫调节的一种重要途径，能够在细菌、寄生虫、病毒的感染和抗肿瘤过程中发挥作用。

通过对小鼠的研究发现，被肿瘤激活的DC释放的外泌体，在体外和体内均能刺激CD8 T细胞增殖，并传递抗原物质与功能性MHC-肽复合物，有效地诱导特异性CTL反应、抗肿瘤免疫和CD8 T细胞记忆[36，65]；而在寄生虫感染过程中，受到抗原刺激的DC能够通过外泌体的方式抵抗炎症反应[66]。同时，DC来源的外泌体能利用功能性IL-15与NKG2D配体直接介导NK细胞的活化[45]，或通过携带TNF超家族配体激活NK细胞TNF-γ的分泌，并能在肿瘤细胞表面表达TNF、FasL和TRAIL，从而触发肿瘤细胞Caspase的活化和凋亡[67]。体外研究则表明，DC来源的外泌体也能够促使NK细胞的增殖与分泌IFNc，抑制肿瘤的转移[68]；还能与细菌Toll样受体配体结合，对未活化的DC有着强烈的激活作用[69]。此外，DC来源的外泌体也会帮助病原体入侵机体。HIV-1会通过刺激树突状细胞免疫受体，来抑制外泌体从DC中释放，并改变外泌体内容物的成分，使之富含促凋亡分子DAP-3，以增加CD4+T淋巴细胞的凋亡[70]。此外，DC来源的外泌体也可能与朊病毒的体内传播有关[71]。

DC来源的外泌体能对T细胞、B细胞、NK细胞以及未激活的DC起作用，其作用包括参与免疫激活、免疫调控与抗肿瘤作用。DC来源外泌体功能的多样性也为研究者们提供了靶向给药的新思路。

3.5NK细胞来源外泌体的抗肿瘤作用 NK细胞的杀伤作用主要有两种机制：①释放穿孔素和颗粒酶，通过增加凋亡小体的形成和caspase-3激活而诱导内在凋亡途径；②涉及caspase-8a的外源性凋亡途径。NK细胞主要通过表达FasL和穿孔素等杀伤蛋白发挥细胞毒性作用，参与抗肿瘤和免疫稳态的调节。而NK细胞在静息和激活条件下都会释放出外泌体，能够作为FasL、颗粒酶B、穿孔素与TNF-α的载体，将其分泌到细胞外[72，73]。同时体外实验表明，这些外泌体能携带NK细胞的标记蛋白CD56，可能参与促进外泌体与靶细胞的黏附，对不同的肿瘤靶细胞和活化的免疫细胞发挥细胞毒活性[74]。NK细胞分泌的携带TNF-α的外泌体还能够在肿瘤处特异性聚集，在体外和体内均对胶质母细胞瘤细胞有靶向和抗肿瘤作用[72]。并且NK细胞也会利用外泌体来激活其他NK细胞的活性，并传递杀伤物质。

根据目前的报道，NK细胞作为杀伤肿瘤的重要细胞，其分泌的外泌体主要作用包括向肿瘤细胞靶向传递杀伤物质以及免疫激活，发挥抗肿瘤功能。

4 展望

外泌体作为一种广泛存在于细胞间的信息传递方式，由于其迅速和直接跨膜的特性而受到广泛关注。随着研究的深入，外泌体在免疫细胞应答过程中的作用逐渐被揭示。外泌体在免疫细胞与肿瘤细胞、干细胞、其他免疫细胞及一些组织细胞间的信息传递中发挥作用，调控机体免疫和肿瘤抵抗过程，其中也不乏双向调控的情况出现。此外，这些机制也与细胞代谢和干细胞分化有关。深入探讨外泌体的免疫调节方式及相关机制，对进一步完善对机体免疫过程的认识具有重要意义，也能够为相关研究提供参考。