王根生 卢锡华 李廷坤 杨青存

(郑州大学附属肿瘤医院麻醉科，郑州 450003)

麻醉药物损伤婴幼儿学习记忆功能一直是大众关注的热点。文献报道，全麻后可能2岁以下婴幼儿造成较长时间的人格及行为变化，这说明全麻药能给婴幼儿中枢神经带来损害[1]。丙泊酚的特点是术后恶心呕吐发生率低、起效快、恢复快、作用时间短，作为一种新型的全身麻醉药被广泛运用于麻醉的诱导、维持及镇静。但是，目前仍未清楚丙泊酚对神经系统损伤机制。

在脑部发育中小脑能够调控其他区域功能形成，两者间有着复杂的联系。许多研究指出，小脑参与情感、认知等高级功能[2,3]，而发生功能障碍时可能导致自闭症、朱比特综合征、唐氏综合征及其他精神疾病产生[4]。长期以来，研究报道指出丙泊酚可能引起运动障碍[5]，这说明丙泊酚能作用于小脑并造成损伤。还有报道指出丙泊酚对小脑组织中重要细胞-蒲肯野细胞活动产生抑制作用[6]，同时对小脑神经环路也造成影响[7,8]。本研究采用Western blot和免疫荧光组织化学检测丙泊酚对新生小鼠小脑神经损伤情况，探讨其对小脑神经损伤作用的可能机制。

1 材料与方法

1.1材料

1.1.1试剂 HE染色剂(北京中杉公司)；荧光二抗、生物素化二抗(Invitrogen 公司)；丙泊酚(AstraZenenca 公司，批号:KV697);BCA试剂盒剂(碧云天公司)；SABC 试剂盒(Vector 公司)；Jagged1、Notch1抗体(BD公司)；10%脂肪乳(安徽丰原药业股份有限公司);DAB 显色试剂盒(北京中杉公司)。

1.1.2仪器 超低温冰箱(Thermo scientific)；低温高速离心机(Thermo公司)；冰冻切片机(Leica CM1950 型)；蛋白电泳仪(Bio-Rad)；照相仪器(ZEISS AX10 型)；Western曝光仪(Bio-Rad)。

1.2方法

1.2.1实验动物与分组 健康临产孕鼠(体质量24～32 g)由郑州大学实验动物中心提供，4月龄。维持动物房22～26℃饲养，自然采光，保证饮水及食物。小鼠刚出生时记为P0，每24 h依次记为P1、P2等。P7 时，随机将新出生小鼠分为三组：对照组(Control group)、30 mg/kg丙泊酚组(Pro 30 mg/kg group)、60 mg/kg丙泊酚组(Pro 60 mg/kg group)[9]，每组各5只。

1.2.2模型建立 P7 时，对照组、低剂量丙泊酚组和高剂量丙泊酚组分别腹腔注射10%脂肪乳溶剂、丙泊酚30 mg/kg、60 mg/kg。24 h后处死小鼠，收取标本作荧光免疫组化(图片分析均选择小脑叶片相同区域)及Western blot试验。

1.2.3HE染色 将取出的小脑组织经4%多聚甲醛溶液固定，包埋，连续切片，厚度约3 μm，行 HE 染色，光镜下观察肺组织病理学改变。

1.2.4免疫组织化学荧光染色 小鼠处死后，取脑标本置于 4%多聚甲醛溶液中固定48 h，石蜡包埋，4 μm厚切片。切片常规脱蜡、水化，置于修复液中微波加热修复，H2O2封闭，PBS 漂洗后 0.3% Triton 37℃ 处理30 min，3%胎牛血清(BSA)封闭反应30 min，滴加适量稀释的大鼠CB、BLBP、GFAP抗体，4℃孵育过夜，PBS 冲洗8 min×3次，将标本置于免疫荧光二抗中，37℃孵育2 h，PBS 漂洗8 min×3次，DAPI 进行复染，再次 PBS 漂洗后漂片，晾干，荧光封片剂封片。

1.2.5Western blot检测 小鼠处死后，迅速取小脑新鲜组织，采用RIPA 裂解法提取总蛋白，并用 BCA 法测定蛋白浓度并调至一致。将蛋白样品和加样缓冲液混合煮沸变性，进行 SDS-PAGE 凝胶电泳，电泳条件：浓缩胶恒压60 V 约 30 min，分离胶120 V 约90 min。转至 PVDF 膜，2.5%脱脂奶粉封闭2 h，加适量一抗Jagged1、Notch1在4℃孵育过夜后，加入二抗室温振荡孵育2 h，经ECL显色后胶片曝光显影，并用Image J软件对条带进行分析。用 Quantity One软件对蛋白质条带进行分析，测定其吸光度(A)值。以A目的蛋白/AGAPDH表示目的蛋白的相对表达量。

2 结果

2.1小脑HE染色 选取新生小鼠小脑叶片同一部位显微观察，对照组、30 mg/kg丙泊酚组、60 mg/kg丙泊酚组间外颗粒层(EGL)厚度比较差异无统计学意义(P>0.05，n=5)，见图1。

2.2免疫荧光检测 与对照组相比，低剂量丙泊酚组蒲肯野细胞数量差异无统计学意义(P>0.05)，而高剂量丙泊酚组蒲肯野细胞数量较对照明显减少(P<0.05，n=5)，见图2。

2.3BLBP、GFAP荧光染色结果 与对照组相比，低剂量及高剂量丙泊酚组BLBP阳性纤维数量减少(P<0.05，n=5)；与对照组相比，低剂量组GFAP阳性纤维数量差异无统计学意义(P>0.05)，而高剂量丙泊酚组GFAP阳性纤维数量较对照组显著减少(P<0.05，n=5)；与对照组相比，丙泊酚高剂量小脑内颗粒层及深部白质区域GFAP阳性纤维光密度值明显上升(P<0.05，n=5)，这说明有星形胶质细胞增生，见图3。

2.4Western blot检测结果 与对照组相比，丙泊酚低剂量组中Jagged1、Notch蛋白表达水平均明显下降(P<0.01,P<0.05)，并且丙泊酚高剂量组中Jagged1、Notch蛋白表达水平较对照组进一步降低(P<0.01,P<0.01)。丙泊酚低剂量和高剂量组中Jagged1蛋白较对照组分别下调23%和32%，而Notch蛋白则分别下调25%和37%，见图4。

图1 新生小鼠小脑HE染色结果(×400)

Fig.1 HE staining of cerebellum in neonatal mice(×400)

Note: A,B and C represent control group,30 mg/kg propofol group and 60 mg/kg propofol group respectively;D.Comparison of outer granule thickness among three groups.

图2 新生小鼠小脑浦肯野细胞染色(×400)

Fig.2 Purkinje cell staining of cerebellum in neonatal mice(×400)

Note: A,B and C represent control group,30 mg/kg propofol group and 60 mg/kg propofol group respectively;D.Number of Purkinje cells,*.P<0.05 vs Control.

3 讨论

丙泊酚是目前临床上的新型麻醉药，具有起效快、功能恢复快且苏醒迅速的特点，主要用于麻醉诱导、维持及 ICU 镇静。研究报道10 min内丙泊酚对婴幼儿剂量分别为25 mg/(kg·h)(<3月)，20 mg/(kg·h)(3～6月)，15 mg/(kg·h)(6～12月)，12 mg/(kg·h)(1～3岁)。研究还发现，新生儿时期如接触麻醉制剂，则可能导致新生儿长期认知改变及大脑受损[10，11]，同时有临床研究报道，新生儿时期麻醉会影响儿童后期学习能力[12]，并且可能是造成行为障碍及脑发育损伤的高危因素[13]。小脑皮层是由颗粒细胞层、浦肯野细胞层及分子层构成，主要包括高尔基细胞、颗粒细胞、浦肯野细胞等，其中颗粒细胞是以谷氨酸为递质的兴奋性神经元，其余高尔基细胞、浦肯野细胞等均是以 GABA 作为递质的抑制性神经元。蒲肯野细胞位于小脑蒲肯野细胞层，是特殊的大细胞神经元。出生后2周内，是蒲肯野细胞发育的主要时期，其细胞结构改变形成多分支状树突生长[14]。在小脑环路中，经蒲肯野细胞整合后发出的信息参与动作学习和动作协调，属于唯一的传出神经元[15，16]。国内外文献报道，新生期注射丙泊酚会导致出生后典型板层结构发生变化，以及海马区细胞丢失[17]。本实验表明，丙泊酚注射后会明显抑制新生小鼠小脑蒲肯野细胞数量(P<0.05)，且抑制程度与剂量相关，这说明小脑可能是丙泊酚的作用靶点，且丙泊酚具有神经毒性作用;伯格曼胶质细胞(Bergman glial cell)为神经胶质细胞的一种，在小脑皮质发育过程中会发出放射状纤维至外颗粒层表面，这种放射状细胞又会分化形成伯格曼细胞[18]。作为Bergman胶质细胞的特异性标记物，GFAP可以同时标记放胶样及星胶样Bergman细胞，而BLBP可以标记放射状胶质细胞。本实验结果显示，丙泊酚麻醉小鼠后，Pro 30 mg/kg组及Pro 60 mg/kg组BLBP阳性纤维数量均较对照组明显减少(P<0.05)；GFAP染色观察结果显示，Pro 30 mg/kg组中GFAP阳性纤维数量较对照组无明显差异，而Pro 60 mg/kg处理后，GFAP胶质纤维数量较对照组明显减少(P<0.05)。同时，Pro 60 mg/kg组内颗粒层和白质中BFAP阳性染色光密度值较对照组明显上升(P<0.05)，这说明丙泊酚可能促进了放胶样到星胶样细胞的转化，从而对伯格曼胶质细胞造成影响。

图3 BLBP、GFAP荧光染色(×400)

Fig.3 Fluorescence staining results of BLBP and GFAP(×400)

Note: A,B and C represent control group,30 mg/kg propofol group and 60 mg/kg propofol group respectively;D,E and F represent control group,30 mg/kg propofol group and 60 mg/kg propofol group respectively;G.GFAP positive fiber number (scale length 100 μm);H.BLBP positive fiber number (scale length 100 μm);I.GFAP positive staining light density value,*.P<0.05 vs Control group；#.P<0.05 vs Control group.

图4 Western blot检测新生小鼠小脑中Jagged1、Notch 蛋白表达Fig.4 Detection of Jagged1 and Notch protein expression in cerebellum of neonatal mice by Western blotNote:A,B and C represent control group,30 mg/kg propofol group and 60 mg/kg propofol group respectively;D.Relative expression level of Jagged1 and Notch protein,*.P<0.01 vs Control group；#.P<0.05 vs Control group.

研究报道，Notch 信号通路是Bergman胶质细胞分化、成熟的相关重要信号通路之一。研究发现，出生后2周内小脑在发育过程中Bergman胶质细胞出现Notch及其配体 Jagged 蛋白表达[19]。此外，小脑中Notch信号通路被激活后还能促进星形细胞向放射状胶质细胞的转化[20]。许多研究表明，小鼠敲除Notch或者Jagged基因后，小脑中伯格曼胶质细胞不仅数量减少并且发育异常，进而导致蒲肯野细胞发育障碍以及颗粒神经元迁移受阻[21]。本研究中Western blot检测结果显示，在丙泊酚低剂量、高剂量处理后Notch 及 Jagged 蛋白表达水平显著下调，提示Notch 信号通路异常与Bergman胶质细胞的损伤、表型失衡和转化相关，而这也可能是丙泊酚引起小脑发育异常的源头。

综上所述，丙泊酚麻醉可明显抑制浦肯野细胞数量、Bergman胶质细胞的发育及纤维形成，同时对小脑中Jagged1、Notch 蛋白表达也产生抑制作用。通过本实验可以看出，小脑作为参与高级认知功能并与大脑有复杂联系的神经组织易受到丙泊酚的神经毒性作用，提示应用丙泊酚要注意对新生儿小脑的影响，也为其治疗提供新的思路及研究方向。