滕昊林 于金宇 刘 念 赵 军 薛立娟

(吉林大学第一医院泌尿外二科,长春 130021)

急性排斥反应是影响移植肾长期存活的危险因素之一，移植排斥反应的实质是炎症反应[1，2]。白细胞介素-17(Interleukin-17，IL-17)与其受体结合，促进多种炎性细胞因子释放，是具有多种功能的前炎性细胞因子，在细胞和体液免疫应答中发挥重要作用[3，4]。研究IL-17在移植急性排斥反应中的表达特点及其对移植物局部损伤的作用，对于提高排斥反应的认识、指导治疗和判断预后具有重要作用[5，6]。

前期我们已经通过对大鼠肾移植急性排斥反应模型的建立，分析了大鼠在急性排斥反应发生时，IL-17在移植肾第3、5、7天的mRNA和蛋白表达情况，基本证实了IL-17在早期就参与了急性排斥反应的发生，并可作为早期的独立预测因子[7]。

本研究采用72例移植肾穿刺活检组织标本，观察外周血中IL-17基因和蛋白水平的表达状态及其在移植肾穿刺活检组织中表达位置，探讨其与移植肾急性排斥反应的相关性及临床意义。

1 材料与方法

1.1材料 PCR试剂盒、Trizol(均为日本 TaKaRa公司产品)，DEPC(美国Fluka公司产品)，IL-17特异性抗体(北京博奥森公司)，EP管、吸头均为无 RNA 酶处理过的产品。

1.2方法 留取在我院行同种异体肾移植术后，72例经病理证实急性排斥反应患者的血液及移植肾组织穿刺标本及部分健康志愿者血液标本。根据穿刺病理及临床检查结果将患者及志愿者分为4组，正常组(Control)：健康志愿者；药物组(CSA)：诊断为免疫抑制剂中毒；排斥组(AR)：诊断为急性排斥反应；稳定组(Stable)：病理未见明显异常。分别提取志愿者及患者血液标本RNA，并进行RT-PCR扩增，电泳后计算每一条目的片段与β-actin对照片段的强度比值，得出基因的相对表达水平，同时使用酶联免疫法定量检测以上4组全血中游离的IL-17蛋白水平，统计和分析在发生排斥反应时各组IL-17基因和蛋白表达的差异情况。

根据移植肾病理banff分级，将移植肾穿刺病理标本进行进一步分组：急性T细胞排斥组(TCMR)；急性抗体介导排斥组(ABMR)；临界改变组(Borderline changes)；未见异常组(Nonspecific changes)。分别进行IL-17免疫组织化学染色，观察IL-17在发生排斥反应时与其他各组在移植肾组织中的主要表达部位及其差异特点，进而对IL-17与TCMR组的小管炎和ABMR组的C4d沉积的相关性进行分析。

1.3统计学处理 采用SPSS17.0统计软件对数据进行数据分析，计量资料符合正态性分布者采用单因素方差分析，计数资料组间差异采用χ2检验或Fisher确切概率法。相关性分析采用Spearman统计，相关系数用r表示。P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1肾移植患者IL-17基因水平的表达 肾移植患者IL-17 的基因相对表达量在正常组、药物组、排斥组和稳定组分别为0.837±0.108、0.705±0.094、1.452±0.071、0.812±0.129，与其他3组比较，排斥组患者IL-17基因的相对表达水平显著升高，差异均具有统计学意义(P<0.05),详见图1。

图1 IL-17的基因相对表达量Fig.1 Relative expression of IL-17 geneNote:*.P<0.05.

2.2肾移植患者血液中的IL-17蛋白水平 酶联免疫定量检测结果表明，正常组、药物组、排斥组和稳定组分别为17.19±2.78、16.57±3.04、34.74±3.15、17.21±3.90，与其他3组比较，排斥组患者血液中的IL-17蛋白水平显著升高(P<0.05)，差异具有统计学意义，详见图2。

图2 IL-17的蛋白表达水平Fig.2 Protein expression level of IL-17Note:*.P<0.05.

2.3IL-17 在移植肾穿刺活检组织中的表达 免疫组织化学染色结果显示，IL-17在各组移植肾穿刺活检组织中均有不同程度表达，IL-17阳性主要定位在肾小管上皮细胞及间质中浸润的炎细胞，偶表达在浸润于肾小球的炎细胞内，而血管上皮细胞未见IL-17表达。

IL-17在移植肾活检组织肾小管表达情况详见表1和图3，统计学分析显示，急性T细胞排斥反应组与未见异常组比较差异有统计学意义(P=0.02)，急性抗体介导排斥组和临界改变组与未见异常组比较差异均无统计学意义(P>0.05)。

表1 IL-17在各组肾小管中的表达

Tab.1 Expression of IL-17 in renal tubules of each group

GroupsnIL-17+-(%)PTCMR3227584.40.02ABMR95455.60.67Borderline changes1811761.60.48Nonspecific changes136746.2-

图3 IL-17在各组肾小管中的表达Fig.3 Expression of IL-17 in renal tubules of each group

IL-17在移植肾活检组织肾间质表达情况详见表2和图4，统计学分析显示，急性T细胞排斥组与未见异常组比较，差异有统计学意义(P=0.004)，急性抗体介导排斥组和临界改变组与未见异常组比较，差异均无统计学意义(P>0.05)。

表2 IL-17在各组肾间质中的表达

Tab.2 Expression of IL-17 in renal interstitium of each group

GroupsnIL-17+-(%)PTCMR3226681.30.004ABMR96366.7 0.192Borderline changes1810855.60.275Nonspecific changes134930.8-

2.4IL-17表达与肾小管炎的关系 免疫组化染色结果显示，IL-17在急性T细胞排斥反应肾小管上皮高表达，而急性T细胞排斥反应多有明显小管炎形成，利用Spearman等级相关分析肾小管炎和IL-17阳性表达的关系，结果显示IL-17表达与小管炎存在呈正相关(r=0.455，P=0.034)，见表3,差异有统计学意义(P<0.05)。

表3 急性T细胞排斥反应中IL-17表达与小管炎相关性分析

Tab.3 Correlation analysis of IL-17 expression in acute T cell rejection and tubules inflammation

nIL-17+-rPBanff(t)+262420.4550.034Banff(t)-633

Note:Banff(t).Tubulitis.

2.5急性抗体介导排斥反应中IL-17表达与C4d沉积的关系 进一步分析，IL-17表达与C4d沉积的关系，Spearman等级相关分析显示，IL-17 表达与C4d沉积呈正相关(r=0.71，P=0.001)，见表4，差异有统计学意义(P<0.05)。

表4 IL-17表达与C4d沉积相关性分析

Tab.4 Correlation analysis between IL-17 expression and C4d deposition

nIL-17+-rPC4d+9630.710.001C4d-909

3 讨论

目前，肾脏移植是治疗终末期肾脏疾病的最佳手段，随着现代新型免疫抑制剂的使用，虽然降低了肾移植后发生排斥反应的比率，但同时也增加了受者感染各种病原体的风险[8]，这使得患者在排斥和过度免疫状态之间动态波动，给术后移植肾功能发生改变时的明确诊断带来困扰。移植肾穿刺活检是诊断急性排斥反应的金标准，但由于其创伤性及有一定并发症的特点，因此非创伤性的方法越来越受到人们的重视。Loverre等[9]在体外培养的人近曲小管上皮细胞中发现，C3a通过JAK2磷酸化诱导IL-17 mRNA高表达，并提出急性排斥反应肾小管上皮细胞是IL-17的产生细胞。

本研究结果也发现，在出现急性排斥反应时肾移植患者IL-17的基因水平和蛋白水平的表达均明显高于稳定组(P<0.05)，表明IL-17在移植肾急性排斥反应的发生发展中发挥重要作用，预示其可以作为一种新的无创性生化标志物用于临床肾移植排斥反应的早期判定，而正常组患者、稳定组患者和免疫抑制剂中毒患者IL-17 在基因及蛋白质水平含量相比差异无显著性，可能由于肾移植术后患者在不出现急性排斥反应时，机体处于相对稳态，各种细胞亚群功能也处于平衡，因此，IL-17检测在鉴别急性排斥反应时可能作为一种有效的诊断标志物。

IL-17作为促炎症反应的调节因子，具有强大的促进多种炎性细胞因子释放及募集中性粒细胞的作用，IL-17与其受体结合后引起靶细胞表达和释放趋化因子、集落刺激因子和黏附分子，招募和激活中性粒细胞从而介导炎症影响免疫损伤的病理过程[10-12]。我们通过对移植肾穿刺活检组织标本进行免疫组织化学染色，结果显示IL-17在急性T细胞介导排斥、急性抗体介导排斥、交界性排斥和未见异常组的移植肾穿刺活检组织中均有不同程度表达，但IL-17阳性细胞主要出现在肾小管上皮细胞及间质中浸润的炎细胞中，亦见于浸润于肾小球的炎细胞，可能是IL-17参与移植肾急性排斥反应的发生。

在急性T细胞排斥反应肾活检组织中，IL-17高表达主要位于肾小管上皮及间质炎细胞中，阳性表达率分别为84.4%(27/32)和81.3%(26/32)。在急性抗体介导排斥反应中，IL-17在肾小管和肾间质中阳性表达率分别为55.6%(5/9)和66.7%(6/9)，与未见明显异常组肾小管(46.2%)和肾间质(30.8%)比较，虽比值增高但差异均无统计学意义(P>0.05)。急性抗体介导排斥反应中IL-17表达与C4d沉积有关，这一结果提示，IL-17和C4d在急性抗体排斥反应进展中发挥重要作用，并预示预后不良。在移植肾临界改变组与未见明显异常组的肾小管中有表达，其阳性表达率分别为61.6%(11/18)和46.2%(6/13)。这部分患者尽管此时无明显的移植肾排斥反应的典型病理改变，但是移植物中已出现IL-17阳性表达，尤其是肾小管中表达的IL-17值得重视。对临界改变组和未见异常组随访中我们发现，2例肾穿病理曾经诊断为未见异常组的患者分别于110 d、320 d后发生移植肾临界改变，而另1例曾经病理诊断为未见异常组的患者20 d后发生慢性活动性T细胞介导排异反应，这也提示我们，有IL-17表达的移植肾组织，其再次发生排斥反应的风险增高，提示IL-17可能是移植物预后不良的危险指标[13]。

综上所述，IL-17可作为监测移植肾功能状态以及预后判断的重要组织学指标，同时，由于移植物IL-17的出现与同种异体免疫反应有关，这为预防及治疗急性排斥反应提供了新思路。