陈艺璇 唐相靖 崔金全

(郑州大学第二附属医院，郑州 450014)

复发性流产(Recurrent miscarriage，RM)是多种危险因素相互作用的结果[1]。妊娠10周之前发生的RM通常称为早期RM[2,3]。研究表明早期RM与妊娠期母胎界面免疫失衡及同种免疫功能紊乱相关，淋巴细胞作为重要的自身免疫细胞，在调节同种免疫功能中起到重要作用[4,5]。外周血淋巴细胞亚群增高与RM患者再次发生流产风险的关系存在争议，因此给临床诊断和治疗造成困惑。本文回顾性研究了RM患者早孕期及非孕期外周血中淋巴细胞亚群百分比的变化，分析淋巴细胞亚群异常与早期RM患者妊娠结局的关系，探讨其诊断及预测意义。

1 材料与方法

1.1临床资料 选取2017年1月至2018年8月于郑州大学第二附属医院进行诊疗的具有早期RM病史的患者153例作为观察对象，其中87例早孕女性，年龄21～45岁，平均(31.69±5.53)岁，孕龄26～65 d，平均(48.29±14.25)d，孕次3～7岁，平均(4.14±1.14)次，早期自然流产2～6次，平均(2.74±0.98)次；66例未孕女性，年龄24～41岁，平均(31.99±5.06)岁，孕次2～9次，平均(3.55±1.90)次，早期自然流产2～6次，平均(3.33±1.59)次；选取同期至我院孕前体检及围产保健的110例既往无不良妊娠及生产史、无遗传病家族史、无慢性病史的健康女性作为对照组，其中68例早孕女性，年龄23～42(30.99±4.67)岁，孕龄32～65 d，平均(50.88±11.22)d；42例未孕健康女性，年龄22～40岁，平均(30.52±4.74)岁。早期RM组纳入标准：①同一性伴侣；②曾经连续2次或2次以上孕龄<10周自然流产的病史；③就诊时孕周<10周。 排除标准：①经阴道超声或者宫腔镜检查确诊子宫解剖结构异常；②内分泌异常：糖尿病、甲状腺功能异常、多囊卵巢综合征、高泌乳素血症、高雄激素血症；③自身免疫抗体阳性：抗核抗体及其提取物、抗心磷脂抗体、抗β2糖蛋白抗体、狼疮凝集物、抗甲状腺抗体；④凝血因子异常：蛋白C、蛋白S、抗凝血酶Ⅲ；⑤夫妇双方染色体异常；⑥其他疾病；⑦男方精液及精子异常。观察组与对照组在年龄、孕龄一般资料无统计学差异(P>0.05)。

1.2检测方法 取患者全血50 μl，加入等体积的溶血剂，离心后去上清，分别加入CD3 FITC/CD8 PE/CD45 PerCP/CD4 APC、CD3 FITC/CD16+CD56 PE/CD45 PerCP/CD19 APC 抗体 20 μl (BD MultiTEST IMK Kit)，避光孵育15 min，加100 μl PBS重悬细胞，FACSCaliburTM流式细胞仪检测CD3+、CD4+、CD8+、CD16+CD56+、CD19+细胞的比率。

2 结果

2.1妊娠结局 87例RM早孕患者中，50例在10周前发生流产，流产率57.47%；68例对照早孕女性中，24例在10周前发生流产，流产率35.29%，二者的流产率差异有明显的统计学意义(P=0.009 3)。

2.2外周血淋巴细胞百分比的差异比较 与110例健康女性相比，153例RM患者外周血CD3+(T淋巴细胞)、CD3+CD4+(Th细胞)、CD3+CD8+(TS细胞)、CD19+(B淋巴细胞)型淋巴细胞百分比没有显著的统计学差异，而CD16+CD56+型淋巴细胞(NK细胞)的百分比(14.26%±5.42%)显著高于对照组(9.56%±4.68%)，P<0.001(图1A)。外周血NK细胞百分比ROC曲线分析(AUC=0.737 8)显示，NK细胞百分比> 17.5%对于RM患者具有高度特异性(94.55%)，敏感度21.57%(95%CI=15.34% to 28.94%),约登指数(Youden index)0.162，似然比(Likelihood ratio)3.954(图1B)。

图1 RM组与对照组外周血淋巴细胞细胞百分比差异Fig.1 Differences in peripheral blood lymphocytes between RM group and control groupNote:A.Percentage difference in each subgroup of lymphocytes;B.Analysis of ROC curve of peripheral NK cells.***.P<0.001.

2.3外周血淋巴细胞亚群百分比在不同亚组之间的差异比较 与RM非孕患者相比，有RM病史的早孕患者外周血T淋巴细胞，Th细胞百分比显著增高(P<0.001),TS细胞百分比差异无统计学意义，NK细胞百分比显著降低(P<0.001);健康对照女性中，早孕女性外周血T淋巴细胞、TS细胞百分比显著增高(P<0.001),Th细胞百分比差异无统计学意义，NK细胞百分比显著降低(P<0.001)。在所有妇女中，孕期NK细胞百分比相对非孕期均显著降低(P<0.001)。RM非孕患者与对照非孕女性相比，Th细胞百分比较低，NK细胞百分比较高，差异均有统计学意义(P<0.05)。见表1。

表1 复发性流产组及对照组淋巴细胞亚群改变及显著性比较

Tab.1 Summary of lymphocyte subsets parameter alterations and significance in RMs compared with Controls

RMs(n=153)Non-pregnant(n=66)x±sMedian(Range) Pregnant(n=87)x±sMedian(Range) tPControls(n=110)Non-pregnant(n=42)x±sMedian(Range) Pregnant(n=68)x±sMedian(Range) tPT70.41±8.3673(56,84)74.16±6.6776(57,83)3.9190.000 71.33±5.0272(64,79)75.79±6.5876.5(59,87)4.0580.000 TH35.73±4.4635(32,45)39.06±6.3240(27,51)3.480.000 38.67±8.6839(20,49)38.21±5.1139(27,55)0.4200.674TS28.89±6.1427(19,43)30.10±7.2931(17,48)1.2640.20629.18±6.2725(22,41)32.43±6.6332(20,46)2.9700.003NK15.81±4.9916(6,32)12.67±4.4813(3,32)3.2810.00111.90±4.3210(7,21)8.96±4.788(1,25)2.6870.007B11.29±3.9310(6,19)11.53±4.1511(6,22)0.2510.80211.62±1.8211(10,15)12.71±3.9112(5,24)0.9960.320

2.4外周血淋巴细胞亚群对妊娠结局的影响 RM组流产者与继续妊娠者相比，外周血T淋巴细胞及B淋巴细胞百分比差异无统计学意义(P>0.05)，NK细胞百分比高于继续妊娠者，差异具有明显的统计学意义(P<0.01)。对于对照组女性，流产者与继续妊娠者淋巴细胞亚群百分比差异均无统计学意义(图2A)。NK细胞百分比与 RM早孕患者妊娠结局的ROC曲线分析(AUC=0.741 6)显示(图2B)，NK细胞百分比> 13.5%对于RM早期流产女性具有高度特异度(86.49%)，敏感度56%(95%CI=41.25% to 70.01%),约登指数(Youden index)0.424 9，似然比(Likelihood ratio)4.144。

图2 外周血淋巴细胞亚群对妊娠结局的影响Fig.2 Influence of peripheral blood lymphocyte subsets for pregnancy outcomesNote:A.Percentage difference in lymphocyte subsets with different pregnancy outcomes;B.ROC analysis of NK cell percentage for pregnancy outcome in early pregnant patients with RM.**.P<0.01.

3 讨论

近年来，免疫型RM的发病率增加[6]。根据免疫类型，RM分为自身免疫型RM和同种免疫型RM。同种免疫型RM分为由NK细胞数量及活性升高、巨噬细胞功能异常、树突状细胞功能异常、补体系统异常等引起的固有免疫紊乱及由T/B淋巴细胞异常、Th1/Th2细胞因子异常引起的获得性免疫紊乱[7]。 越来越多的研究表明母胎界面的淋巴细胞构成的免疫调节网络在维持正常妊娠中起重要作用[8-12]。

T淋巴细胞是人体主要的CD3+型免疫细胞，根据T淋巴细胞表型的不同，可分为CD3+CD4+辅助型T细胞和CD3+CD8+抑制型(细胞毒性)T细胞。辅助型T细胞通过分泌各种细胞因子，参与体内免疫调控和免疫耐受调节，诱导母胎界面免疫耐受，影响胚胎着床、滋养细胞侵蚀及胚胎正常发育[4,5,13-15]。既往研究表明，未孕RM患者和具有正常生育能力的未孕妇女外周血 T淋巴细胞、Th细胞百分比水平无差异，而TS细胞百分比增加有统计学意义[16]。在本项研究中，RM患者与健康对照女性相比，T淋巴细胞亚群无明显差异；在所有妇女中，早孕女性的T淋巴细胞百分比均高于未孕女性。有趣的是RM早孕患者以Th细胞百分比增高为主，而正常对照早孕女性以TS细胞增高为主，结果提示复发性流产患者妊娠可能与正常妊娠免疫调节的方向有所不同，主要是以辅助型T细胞百分比增加为主，通过增加其分泌的细胞因子，加强免疫调节，促使及维持妊娠。

NK细胞是一种大颗粒淋巴细胞，对肿瘤细胞和感染细胞具有细胞毒性，同时可以产生各种细胞因子，参与调节适应性免疫反应[17,18]。既往研究表明，外周血NK细胞异常与原因不明的RM有因果关系，并可能参与 RM的病理生理学。NK细胞异常一方面可导致母体固有免疫紊乱，另一方面可攻击绒毛滋养层细胞，阻碍绒毛侵蚀及母胎循环建立，从而导致流产，而这一现象在正常流产中并不显著。Ebina等[19]的研究提示外周血NK细胞的活性增加与不明原因的RM相关。且RM子宫NK细胞功能及活性异常，与外周血NK细胞数目增加有关[20]，通过下调外周血NK细胞的百分比能够改善复发性流产患者的妊娠结局[11]。本研究发现，复发性流产患者NK细胞百分比明显高于正常对照女性。外周血NK细胞百分比17.5%是一个可以尝试诊断自身免疫型RM患者NK细胞异常的标准。在King等[21]的研究中比较RM组和对照组之间的NK细胞百分比的ROC分析(AUC=0.706)显示，NK细胞百分比> 18%对于RM(97.0%)女性具有高度特异性，Hajar Adib Rad等[22]的研究提示复发性流产非孕女性外周血NK细胞百分比相对于正常对照女性增加，在复发性流产患者评估中具有预测价值，本研究结果与之相符。RM患者中，流产患者的NK细胞百分比明显高于继续妊娠患者，表明NK细胞百分比增高对复发性流产患者再次妊娠结局有不良影响。ROC曲线分析提示RM患者早孕期NK细胞百分比小于13.5%有良好的妊娠结局。这可能是RM早孕患者是否进行免疫调节治疗的新转折点。 总之，外周血淋巴细胞亚群百分比的异常直接反映了RM妊娠建立中存在着免疫功能紊乱。NK细胞百分比可作为预测RM患者再次妊娠结局的一个潜在指标，为RM患者孕期是否进行免疫治疗提供理论依据。然而，NK细胞百分比增高导致流产的病理机制及高NK水平的RM患者的NK水平应控制到多少才会从免疫治疗中获益有待进一步的研究。