贺 攀 赵肃清 杨慧怡 余林金 卢明磊 魏秀婷

(广东工业大学生物医药学院，广州 510006)

伴放线聚集杆菌(Aggregatibacteractinomycetemcomitans,Aa)是青少年局限型侵袭性牙周炎的主要致病菌[1]。严重的牙周炎可导致咀嚼受损、牙根暴露、牙齿松动、牙齿脱落等症状[2]。目前主流的治疗方法是联合使用基础治疗(如洁治、刮治、根面平整等)和抗生素[3]，但滥用抗生素导致耐药细菌株的出现已成为一个全球性问题[4,5]。亟需寻找新的治疗方法。

卵黄抗体(Egg yolk antibody,IgY)是禽类血清中的主要免疫球蛋白，产蛋禽类经特异性抗原免疫后，所产生的特异性卵黄抗体可以从血液中转移至卵黄中富集。卵黄抗体具有靶向性强、副作用低、无污染、无需采血、易于大量生产等优点，广泛应用于多种病原微生物疾病的预防和治疗[6]。在口腔方面，通过口服被动免疫途径，抗具核梭杆菌和中间普氏菌的特异性卵黄抗体被用于治疗牙周疾病[7,8]，具有代替抗生素的潜力[9]。因此，本研究制备抗伴放线聚集杆菌卵黄抗体，研究其体外生物活性，为预防和治疗牙周疾病提供理论依据。

1 材料与方法

1.1材料

1.1.1实验菌株 伴放线聚集杆菌(ATCC 29523,GIM 1.393)购买于广东省微生物菌种保存中心。

1.1.2实验动物 选取6只20周龄的健康产蛋母鸡，饲养于广州太和良田良沙养鸡厂。

1.1.3培养基 血平板琼脂培养基，胰蛋白胨大豆肉汤培养基。

1.1.4主要试剂和仪器 弗氏完全佐剂和弗氏不完全佐剂 (Sigma,美国)；辣根过氧化物酶标记的兔抗鸡二抗(EarthOx,美国)；异硫氰酸荧光素标记的驴抗鸡二抗 (上海生工生物工程有限公司)；抗荧光淬灭封片剂 (北京索莱宝科技有限公司)；其他试剂为国产分析纯。超滤膜包 (Sartorius,德国)；真空冷冻干燥机 (北京松源华兴科技发展有限公司)；酶标分析仪 (Thermo scientific MultiskanTMFC,美国)；倒置荧光显微镜 (Olympus IX71,日本)。

1.2方法

1.2.1培养伴放线聚集杆菌 将伴放线聚集杆菌接种在血平板上，于细胞培养箱中培养24 h (37℃，5% CO2)，从固体培养基中接种细菌至胰蛋白胨大豆肉汤培养基中增菌培养，离心 (4℃，6 000 r/min，10 min) 收集沉淀并用PBS溶液洗涤3次。

1.2.2制作抗原与免疫蛋鸡 抗原的制作按照Xu等[10]的实验方案并稍作修改。往伴放线聚集杆菌沉淀中加入0.5%的甲醛溶液并混匀，4℃过夜灭活，用PBS溶液洗涤3次，调节伴放线聚集杆菌悬液浓度至1×109CFU/ml。菌悬液与等体积的弗氏佐剂混合，乳化充分后，采用肌肉注射方式免疫产蛋母鸡，每隔9 d免疫1次，共8次。初次免疫使用弗氏完全佐剂，后7次加强免疫用弗氏不完全佐剂。第2次免疫后收集鸡蛋，连续收集3个月，并按照天数进行编号，取未免疫母鸡的鸡蛋作为阴性对照。

1.2.3卵黄抗体的分离与纯化 参考Xu等[10]实验方案提取卵黄抗体并稍作修改。酒精消毒鸡蛋，破壳并用蛋清分离器分离蛋清与卵黄。收集卵黄液并量取体积，向卵黄液中加入9倍其体积的双蒸水 (pH5.0～5.2) 进行稀释，搅拌均匀后，于4℃静置过夜。离心 (4℃,10 000 r/min,15 min) 收集上清液，用滤纸过滤，得到水溶性卵黄抗体提取物。然后向提取物中加入饱和硫酸铵溶液使其饱和度达到50%，离心 (4℃,8 000 r/min,20 min) 收集沉淀。继续加入3倍卵黄液体积的19%硫酸钠溶液，离心 (4℃,8 000 r/min,20 min) 收集沉淀。将沉淀溶于PBS溶液，用50 kD膜包超滤，最后用冷冻真空干燥机干燥成粉末，于-20℃保存备用。

1.2.4十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE) 采用SDS-PAGE凝胶电泳 (5%的浓缩胶，10%的分离胶) 分析卵黄抗体的相对分子量和纯度[11]。

1.2.5间接酶联免疫吸附实验(ELISA)测抗体效价 ELISA实验综合参考了Li等[12]和韦传宝等[13]的实验方法并稍作修改。用碳酸盐包被缓冲液 (CBS，pH9.6，0.05 mol/L) 将伴放线聚集杆菌悬液稀释至3×107CFU/ml，包被于96孔酶标板，100 μl/孔，4℃包被过夜，倾倒液体，用PBST溶液 (含有0.05%吐温-20的PBS) 洗板3次，用吸水纸拍干酶标板后。加入3%的脱脂奶粉溶液封闭(100 μl/孔)，37℃孵育1 h，如上洗涤拍板操作后。对特异性卵黄抗体 (1 mg/ml,1∶10) 进行倍比稀释，用非特异性卵黄抗体作为阴性对照， 37℃孵育1 h，倾倒酶标板孔中液体，如上洗涤拍板操作后。每孔加入100 μl辣根过氧化物酶标记的兔抗鸡二抗溶液 (1∶5 000)，37℃孵育1 h，然后甩干孔中液体，如上洗涤拍干操作后。加入现配的3,3′,5,5′-四甲基联苯胺 (TMB) 显色液 (100 μl/孔)，37℃孵育15 min，用浓度为2 mol/L的H2SO4溶液终止反应 (50 μl)。检测450 nm处的吸光值 (OD)。以阳性孔OD值≥2.1倍阴性孔OD值时的最大稀释倍数作为特异性卵黄抗体的效价。

1.2.6间接免疫荧光实验检测抗体的特异性 间接免疫荧光实验综合参考了Li等[14]和向江艳等[15]的实验方法并稍作修改。将3×107CFU/ml伴放线聚集杆菌悬液与等体积含1%牛血清白蛋白的PBS缓冲溶液和特异性卵黄抗体溶液(10 μg/ml)、非特异性卵黄抗体(10 μg/ml)进行混合。在37℃下孵育 1 h，离心 (4℃,8 000 r/min,10 min) 收集细菌沉淀，洗涤3次后。加入100 μl异硫氰酸荧光素标记的驴抗鸡二抗溶液(1∶100)，在37℃下孵育1 h，洗涤3次后，洗涤样品并重悬于50 μl溶液中。然后，取少量悬浮液滴加至载玻片上，于阴暗环境下风干，滴加抗荧光淬灭封片剂，盖好盖玻片。最后用倒置荧光显微镜观察荧光现象。

1.2.7细菌凝集试验 细菌凝集实验按照Qin等[16]的实验方法并稍作修改。在超净工作台上，将特异性卵黄抗体溶液、非特异性卵黄抗体溶液以及PBS溶液全部用水系0.22 μm的微孔滤膜过滤除菌。然后，将血平板上培养24 h的伴放线聚集杆菌用接种环转移至无菌PBS中，调节细菌浓度至1×108CFU/ml，伴放线聚集杆菌悬液分别与等体积特异性卵黄抗体溶液(0.5 mg/ml)、非特异性卵黄抗体溶液(0.5 mg/ml)、PBS溶液在孔中混合，室温下作用1 h后，在显微镜下观察菌群的凝集现象。

1.2.8抑制伴放线聚集杆菌生物被膜的形成 用结晶紫染色定量法分析细菌生物被膜形成的量，参考Xu等[8]的实验方案并稍微修改。用胰蛋白胨大豆肉汤培养基培养伴放线聚集杆菌，调节菌悬液浓度至6×107CFU/ml，分别与等体积过滤除菌的特异性卵黄抗体溶液(2、4、8 mg/ml)、非特异性卵黄抗体溶液(8 mg/ml)、氨苄青霉素溶液(0.1 mg/ml)以及PBS溶液混合。然后，将100 μl不同组的混合液加入到96孔细胞培养板中，每组做3个平行， 37℃培养24 h后，倾倒培养物。用蒸馏水漂洗培养板2次，用 50 μl浓度为0.5%结晶紫染色15 min，洗涤3次后，用200 μl浓度为95%的乙醇溶解结晶紫，用酶标仪测孔中溶液的OD595 nm。

2 结果

2.1SDS-PAGE凝胶电泳 卵黄抗体的SDS-PAGE如图1所示，卵黄抗体在沸水浴和二硫苏糖醇(DTT)作用下，二硫键打开，裂解成分子量约为70 kD 的重链和25 kD的轻链，与理论一致。从图 1中还可以观察到，水稀释提取的卵黄抗体含有较多的杂质蛋白，进一步经过硫酸铵盐析、硫酸钠盐析纯化后，抗体纯度得到提高，基本无明显杂质蛋白条带。超滤冻干后的抗体电泳图与超滤前基本一致，这与Xu等[8]实验报道相似。

图1 卵黄抗体的SDS-PAGE分析Fig.1 IgY was analyzed by SDS-PAGENote:M.Marker;1.Water-soluble fractions;2.Fractions collected after (NH4)2SO4 precipitation;3.Fractions collected after Na2SO4 precipitation;4.IgY from freeze-dried powder.

2.2间接ELISA检测抗体效价变化 卵黄抗体效价随时间的变化如图2所示，初次免疫5次后，抗体的效价迅速升高，特异性卵黄抗体效价达到峰值(1∶10 240)，并持续30 d。然后抗体效价开始下降，实验表明特异性卵黄抗体能结合伴放线聚集杆菌。

图2 抗伴放线聚集杆菌卵黄抗体的效价随时间的变化Fig.2 Titer of anti-Aa IgY was changed after first immunization

2.3间接免疫荧光检测抗体的特异性 荧光表示卵黄抗体与伴放线聚集杆菌阳性结合。荧光强弱间接反映卵黄抗体与伴放线聚集杆菌的结合程度。从图3A中看出，特异性卵黄抗体组荧光较强并且黄绿色荧光点数量较多，表明特异性卵黄抗体与伴放线聚集杆菌结合较强。而图3B和图3C中，荧光较弱，基本观察不到荧光点。表明非特异性抗体和PBS溶液与伴放线聚集杆菌结合较弱或不结合。实验结果表明卵黄抗体与伴放线聚集杆菌的结合具有较强的特异性。

图3 伴放线聚集杆菌与卵黄抗体结合的免疫荧光图(×200)Fig.3 Specific binding activity of IgY against Aa was revealed by micrographs of indirect immunofluor-escence(×200)Note:A.Specific IgY;B.Nonspecific IgY;C.PBS.

2.4细菌凝集实验 细菌凝集实验结果如图4所示。图4A中，特异性卵黄抗体能识别伴放线聚集杆菌，其菌群发生共凝集现象。图4B和4C中，细菌分散比较均匀，无凝集现象。单个伴放线聚集杆菌个体微小，放大400倍不足以明显看清，但在显微镜下能明显地观察到凝集成团的伴放线聚集杆菌的菌群。这是卵黄抗体与伴放线聚集杆菌高特异性结合所致。

2.5卵黄抗体抑制伴放线聚集杆菌生物被膜的形成 用结晶紫染色定量法分析卵黄抗体对伴放线聚集杆菌形成生物被膜能力的影响。结果如表1所示，特异性卵黄抗体组的吸光值显著小于(P<0.05)空白对照组(PBS溶液)和阴性对照组(非特异性抗体组)的吸光值，相对于阴性对照组和空白对照组来说，特异性抗体组中，伴放线聚集杆菌的生物被膜形成量少。同时特异性卵黄抗体组中生物被膜形成的量与其浓度有关，浓度高，吸光值小，形成生物被膜少。这说明特异性卵黄抗体以剂量依赖性的方式抑制伴放线聚集杆菌生物被膜的形成。

图4 伴放线聚集杆菌与卵黄抗体作用的凝集图(×400)Fig.4 Specific IgY acted on Aa was revealed by photomicrographs of microbial agglutination assay(×400)Note:A.Specific IgY;B.Nonspecific IgY;C.PBS.

表1 特异性卵黄抗体抑制伴放线聚集杆菌形成生物被膜

Tab.1 Inhibition effect of specific IgY on biofilm formation ofAa

TreatmentsOD595 nmAa+PBS0.580±0.0601)Aa+8 mg/ml specific IgY0.224±0.0102)Aa+4 mg/ml specific IgY0.244±0.0062)3)Aa+2 mg/ml specific IgY0.291±0.0183)4)Aa+8 mg/ml nonspecific IgY0.443±0.0285)Aa+0.1 mg/ml ampicillin0.150±0.0036)

3 讨论

侵袭性牙周炎的病因包括牙菌斑微生物及造成其滞留的局部因素、机体防御能力缺陷的全身因素、遗传因素等[17]。伴放线聚集杆菌是牙菌斑微生物中的主要牙周致病菌之一[1]。本研究的主要目的在于制备抗伴放线聚集杆菌的卵黄抗体，为牙周炎的治疗寻找新方法。

卵黄抗体的提取方法有水稀释提取法、聚乙二醇沉淀法、硫酸葡聚糖沉淀法等[18]。水稀释法获得抗体的产量和纯度较高，大规模生产的可能性和应用的方便性也优于其他方法[19]。本文采用水稀释法提取卵黄抗体，粗提取的卵黄抗体含较多杂质蛋白条带，进一步采用盐析和超滤处理，冻干后的卵黄抗体基本无明显杂质蛋白条带，说明抗体的纯度得到了提高。此外，间接免疫荧光实验显示卵黄抗体与伴放线聚集杆菌结合具有较强的特异性。卵黄抗体能特异性地识别伴放线聚集杆菌，引起菌群产生共凝集现象，这种特异性结合作用可能会减少细菌的活动，抑制细菌黏附于牙周组织。

近年来，卵黄抗体被应用于牙周疾病的被动免疫治疗，具有代替抗生素治疗的潜力。Xu等[8]使用具核梭杆菌免疫母鸡制备的抗具核梭杆菌卵黄抗体，能减少昆明鼠牙槽骨的损失。Hou等[7]用灭活中间普氏菌免疫产蛋母鸡，获得特异性卵黄抗体能有效抑制中间普氏菌生长，保护大鼠免受中间普氏菌引起的牙龈炎。在口腔中，多种微生物以生物被膜的形式黏附在牙齿、牙龈、口腔黏膜的表面或内部等部位，其中黏附于牙表面的生物被膜被称之为牙菌斑[4]。牙菌斑为口腔微生物的生长提供有利的条件，不仅能抵挡液体(比如水)的冲刷，还能增强细菌对宿主免疫系统的抵抗力和降低细菌对抗生素的敏感性[3]。牙菌斑还能为一些厌氧细菌定植提供条件，微生物之间的协同作用将促进其生长和繁殖[14]。在本研究中，特异性卵黄抗体显著抑制伴放线聚集杆菌生物被膜的形成，破坏伴放线聚集杆菌的生长环境，可能有助于减少伴放线聚集杆菌黏附于牙周组织，减少其他种类微生物的定植，减少牙菌斑的形成。这表明卵黄抗体具有代替抗生素来防治牙周疾病的潜力。

本研究用伴放线聚集杆菌免疫产蛋母鸡，通过水稀释、硫酸铵沉淀、硫酸钠沉淀等方法得到纯度较高的卵黄抗体，卵黄抗体具有较高的效价和特异性。特异性卵黄抗体能促使伴放线聚集杆菌的菌群产生共凝集现象，有效抑制其形成生物被膜。研究成果为卵黄抗体被动免疫治疗牙周疾病提供理论依据，也为卵黄抗体大规模制备提供参考。