韩耀伦 王 璐 马 欣

(河南省人民医院口腔科,郑州 450000)

牙髓炎是常见的口腔疾病，如果不能得到积极的治疗可引起牙根尖周组织炎症、咀嚼障碍、牙列缺损等；牙髓炎最重要的致病因素为微生物感染，脂多糖是牙髓炎的主要毒力因子，容易引起牙髓组织的炎症反应，因此降解脂多糖、抑菌等消除感染因素在治疗牙髓炎中具有重要意义[1，2]。盖髓剂在牙髓的保存治疗中发挥重要作用，目前使用的盖髓剂不能降解脂多糖等毒性产物、不能抗炎抑菌，因此不能从根本上保护牙髓细胞。黄芩苷具有抗炎、抑菌、降解脂多糖等作用[3，4]，研究发现用黄芩苷糊剂盖髓治疗犬实验性牙髓炎的效果优于Dycal的盖髓效果[5]。但黄芩苷抑制牙髓炎症的机制尚不十分清楚，研究发现黄芩苷可通过调控TLR4/NF-κB信号通路在多种疾病中发挥作用[6]。本文通过对黄芩苷对大鼠牙髓细胞的保护作用及对TLR4/NF-κB信号通路的影响进行研究，探讨黄芩苷是否通过TLR4/NF-κB通路抑制牙髓炎的炎症反应从而发挥保护牙髓细胞的作用。

1 材料与方法

1.1材料

1.1.1实验动物 健康、清洁级、8周龄、雌雄各半、体重240～290 g、SD大鼠36只购自中国科学院微生物研究所，许可证号：SYXK(京)2014-0032。

1.1.2主要试剂和仪器 黄芩苷(中国药品生物制品鉴定所)，玻璃离子液剂和粉剂(美国3M公司)，RIPA裂解液、氯仿、异丙醇、BCA蛋白浓度测定试剂盒(美国Sigma公司)，RT-PCR试剂盒、ELISA试剂盒(美国Invitrogen公司)，TLR4抗体、NF-κB抗体(美国Abcam公司)，高速离心机(日本NSK公司)，7500荧光定量PCR仪(美国LIGHT ABI公司)。

1.1.3黄芩苷糊剂[5]将黄芩苷和生理盐水调和成稠糊状。

1.2方法

1.2.1实验动物分组 将36只大鼠根据随机数字法分为对照组、牙髓炎组和黄芩苷组，每组12只。每只大鼠选择左上颌和右上颌第一、第二磨牙进行实验，每组共48只实验牙。

1.2.2大鼠模型建立及处理[7]将36只大鼠麻醉成功后仰卧固定，乙醇消毒实验牙，在喷水冷却下钻磨实验牙中央窝，钻至深层牙本质近髓透红，用扩孔锉捅开牙髓腔，用探针将开髓孔扩大至直径0.5 mm，无菌生理盐水冲洗，棉球止血、擦干。将含1 μl大肠杆菌标准脂多糖(浓度5 g/L)的棉捻放置开髓孔处30 min，然后用生理盐水冲洗、擦干，黄芩苷组放置黄芩苷糊剂盖髓，牙髓炎组不放盖髓材料，然后用玻璃离子水门汀封洞。对照组大鼠不做任何干预。

1.2.3标本采集 术后7 d，全麻成功后脱颈处死大鼠，获取大鼠上颌骨和牙齿标本，每只大鼠取1只实验牙用于牙髓组织HE染色，1只实验牙用于牙髓组织中TNF-α、IL-6含量测定，1只实验牙用于牙髓组织中TLR4和NF-κB mRNA水平测定，1只实验牙用于牙髓组织中TLR4和NF-κB蛋白水平测定。

1.2.4牙髓组织HE染色 将大鼠的上颌骨及牙齿标本用甲醛固定48 h，乙二胺四乙酸二钠脱钙1个月，酒精梯度脱水，石蜡包埋，4 μm厚连续切片，进行常规HE染色，显微镜下观察牙髓染色情况。并对牙髓炎组和黄芩苷组的牙髓组织进行病理学评价[8]，组织紊乱程度分为0～3级：正常组织为0级，中心牙髓组织正常、成牙本质细胞层紊乱为1级，全部牙髓组织失去正常形态为2级，牙髓坏死为3级。细胞炎症反应分为0～3级：开髓孔对应牙髓组织中仅有个别或无炎症细胞为0级，轻度炎症细胞浸润为1级，中度炎症细胞浸润为2级，重度炎症细胞浸润或形成脓肿为3级。硬组织形成分0～3级：无硬组织形成为0级，穿髓孔下少量硬组织形成为1级，穿髓孔下中等量硬组织形成为2级，穿髓孔下大量硬组织形成为3级。

1.2.5牙髓组织中TNF-α、IL-6含量测定 收集大鼠牙髓组织标本，采用ELISA法测定牙髓组织中TNF-α、IL-6含量：在常温下将冻干标准品瓶中加入离子水将TNF-α、IL-6浓度调为250 pg/ml，静置15 min，把TNF-α、IL-6全部溶解，将标准品稀释倍比梯度稀释溶液依次加入检测孔中(标准品稀释浓度从 0～250 pg/ml，标准曲线取7个点)。计算一次实验需要的板条数，将全部板条取出放在框架内，将标本和不同浓度标准品加入到相应孔中，用封板胶纸封住反应孔孵育120 min，加入洗涤液洗板5次，加入生物素化抗体工作液孵育60 min，洗板5次，加入酶结合物工作液孵育20 min，洗板5次，加入显色剂TMB孵育20 min，加入终止液，使用酶标仪测定波长450 nm处吸光度值。以标准品浓度吸光度值为坐标，绘制标准曲线，根据标准曲线计算样品TNF-α、IL-6浓度。

1.2.6牙髓组织中TLR4和NF-κB mRNA水平测定 小心剥离大鼠磨牙，取出牙髓组织标本，用匀浆器进行研磨，加入Trizol提取牙髓组织总RNA，将牙髓RNA反转录为cDNA，采用RT-PCR测定牙髓组织中TLR4和NF-κB mRNA水平，PCR反应条件为95℃ 5 min，95℃ 30 s、58℃ 1 min、72℃ 30 s，共38个循环，72℃ 1 min。以2-ΔΔCt表示牙髓组织中TLR4和NF-κB mRNA水平。TLR4引物序列：上游引物：5′-GGCATGATGTTGATTCTCGTTG-3′，下游引物：5′-AGCATTCTGGTCCGACTGC-3′。NF-κB引物序列：上游引物：5′-CTGAAGGACCGCGATACGTCT-3′，下游引物：5′-GAGAAGTGGATCTGCCGAAT-3′。

1.2.7牙髓组织中TLR4和NF-κB蛋白水平测定 小心剥离大鼠磨牙，取出牙髓组织标本，用匀浆器进行研磨，加入RIPA裂解液提取牙髓组织总蛋白，用BCA法测定牙髓总蛋白浓度，采用Western blot法测定牙髓组织中TLR4和NF-κB蛋白水平。进行上样、电泳、转膜、封闭，加入一抗(TLR4抗体为1∶100，NF-κB抗体为1∶100)，过夜孵育，以β-actin为内参照，加入二抗，孵育1 h。用Odyssey成像仪成像，以Image J分析蛋白的灰度值。TLR4和NF-κB蛋白水平以TLR4和NF-κB蛋白条带灰度值/β-actin条带灰度值表示。

2 结果

2.1三组大鼠牙髓组织HE染色 对照组大鼠牙髓组织正常：成牙本质层细胞排列整齐，无血管扩张充血，无明显中性多核细胞浸润。牙髓炎组大鼠牙髓组织中成牙本质细胞排列明显紊乱，血管扩张充血明显，见大量中性多核白细胞浸润，表明牙髓炎模型建立成功。黄芩苷组大鼠牙髓组织中成牙本质细胞排列紊乱、血管扩张充血、中性多核白细胞浸润程度均较牙髓炎组轻，介于牙髓炎组和对照组之间。见图1。

2.2牙髓炎组和黄芩苷组大鼠牙髓组织病理学评价指标比较 黄芩苷组大鼠牙髓组织紊乱分级和细胞炎症反应分级均低于牙髓炎组(P<0.05)，硬组织形成分级与牙髓炎组比较差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。

表1 牙髓炎组和黄芩苷组大鼠牙髓组织病理学评价指标比较

Tab.1 Comparison of pathological evaluation indexes of pulp tissue in rats in pulpitis group and baicalin group

GroupsnTissue disorderclassification (grade)Cytoinflammatory responseclassification (grade)Hard tissue formationclassification (grade)Pulpitis group122.13±0.542.46±0.470.97±0.31Baicalin group121.24±0.431.08±0.360.89±0.28t4.4668.0750.663P0.0000.0000.514

2.3三组牙髓组织中TNF-α、IL-6含量比较 与对照组比较，牙髓炎组和黄芩苷组牙髓组织中TNF-α、IL-6含量升高(P<0.05)，与牙髓炎组比较，黄芩苷组牙髓组织中TNF-α、IL-6含量降低(P<0.05)。见表2。

表2 三组牙髓组织中TNF-α、IL-6含量比较

Tab.2 Comparison of TNF-α and IL-6 levels in pulp tissue of three groups

GroupsnTNF-α(pg/ml)IL-6(pg/ml)Control group124.87±2.135.41±2.24Pulpitis group1234.52±2.641)29.85±2.731)Baicalin group1215.36±2.431)2)13.97±2.511)2)F467.372294.960P0.0000.000

Note：Compared with control group，1)P<0.05；compared with pulpitis group，2)P<0.05.

2.4三组牙髓组织中TLR4和NF-κB mRNA水平比较 与对照组比较，牙髓炎组和黄芩苷组牙髓组织中TLR4和NF-κB mRNA水平升高(P<0.05)，与牙髓炎组比较，黄芩苷组牙髓组织中TLR4和NF-κB mRNA水平降低(P<0.05)。见表3。

图1 三组大鼠牙髓组织HE染色(×100)Fig.1 HE staining of rat dental pulp tissue of three groups (×100)

表3 三组牙髓组织中TLR4和NF-κB mRNA水平比较

Tab.3 Comparison of TLR4 and NF-κB mRNA levels in pulp tissue of three groups

GroupsnTLR4 mRNANF-κB mRNAControl group121.00±0.091.00±0.08Pulpitis group123.14±0.131)3.42±0.141)Baicalin group122.23±0.121)2)2.53±0.111)2)F1 053.8981 415.654P0.0000.000

Note：Compared with control group，1)P<0.05；compared with pulpitis group，2)P<0.05.

表4 三组牙髓组织中TLR4和NF-κB蛋白水平比较

Tab.4 Comparison of TLR4 and NF-κB protein levels in pulp tissue of three groups

GroupsnTLR4 proteinNF-κB proteinControl group120.17±0.080.14±0.09Pulpitis group120.39±0.131)0.93±0.161)Baicalin group120.26±0.111)2)0.47±0.141)2)F12.441106.334P0.0000.000

Note：Compared with control group，1)P<0.05；compared with pulpitis group，2)P<0.05.

图2 三组牙髓组织中TLR4和NF-κB蛋白Western blot电泳图Fig.2 Western blot analysis of TLR4 and NF-κB proteins in pulp tissue of three groupsNote:A.Control group；B.Pulpitis group；C.Baicalin group.

2.5三组牙髓组织中TLR4和NF-κB蛋白水平比较 与对照组比较，牙髓炎组和黄芩苷组牙髓组织中TLR4和NF-κB蛋白水平升高(P<0.05)，与牙髓炎组比较，黄芩苷组牙髓组织中TLR4和NF-κB蛋白水平降低(P<0.05)。见表4、图2。

3 讨论

牙髓炎的主要病因是病原微生物感染，厌氧菌是牙髓炎的优势菌，以革兰阴性菌最多；细菌进入牙髓后可产生多种有害物质，产生的有害物质可直接损伤组织细胞，或通过免疫反应、炎症反应等间接损伤组织。感染牙髓的厌氧菌的内毒素、菌体表面物质、各种毒性酶等均为致病物质，其中革兰阴性菌细胞壁产物-内毒素是比较重要的毒性产物，内毒素的主要毒性成分为脂多糖中的类脂A，脂多糖是引起细胞损伤的主要毒力因子[9]。脂多糖对牙髓的损伤表现在：脂多糖为低分子物质，具有比较强的渗透性，因此更容易通过牙本质小管、牙根尖孔以及牙侧支根管等，刺激牙髓组织，使牙髓组织处于炎症状态[10]；脂多糖对牙髓成纤维细胞具有细胞毒性作用，可引起牙髓的免疫、炎症反应；脂多糖是一种强烈的致炎因子，在炎症牙髓中聚集了大量树突状细胞、巨噬细胞等，上述细胞作为脂多糖的靶细胞，将脂多糖的炎症信号通过TLR4等传递到细胞内[11,12]，刺激NF-κB等转录因子进入细胞核中，激活TNF-α、IL-6、IL-8、IL-2等基因表达，从而启动炎症反应[13-15]。本研究通过对大鼠磨牙开髓并在开髓孔处放置脂多糖建立牙髓炎模型，发现牙髓炎模型大鼠牙髓组织出现明显炎症反应，牙髓组织中TNF-α、IL-6含量升高，TLR4和NF-κB mRNA和蛋白水平也升高，表明脂多糖建立牙髓炎模型成功，脂多糖刺激牙髓中的树突状细胞、巨噬细胞等靶细胞，将脂多糖的炎症信号通过TLR4等传递到细胞内，刺激NF-κB等转录因子进入细胞核中，从而激活TNF-α、IL-6等下游炎症细胞因子，启动炎症反应，导致牙髓炎的发生。

黄芩的干燥根是药用部分，黄酮类化合物为其主要成分，包括黄芩苷、汉黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素、黄芩新素等[16,17]，其中黄芩苷是药理作用最强的有效成分，具有抗菌、消炎、抗氧化、清除自由基、调节免疫反应等多种生物学效应[8-20]。黄芩苷可通过多种信号通路发挥其生物学效应，在抑制炎症反应中，可通过抑制TLR4/NF-κB信号通路发挥抑制炎症反应的作用，如欧阳龙强等[21]研究发现小鼠癫痫发作后可激活TLR4/NF-κB介导的炎症信号通路引起海马神经细胞的损伤，黄芩苷可通过抑制信号通路及其下游炎症细胞因子水平，发挥对癫痫小鼠海马神经细胞的保护作用；李敏等[22]研究发现黄芩苷可通过抑制TLR4/NF-κB信号通路抑制CCL4诱导的肝星状细胞炎症反应，从而改善肝纤维化。本研究对牙髓炎大鼠采用黄芩苷糊剂盖髓，发现与牙髓炎组比较，黄芩苷组大鼠牙髓组织炎症反应级别和组织紊乱程度均降低，TNF-α、IL-6含量降低，TLR4和NF-κB mRNA和蛋白水平也降低。表明黄芩苷对牙髓炎具有抑制作用，其机制可能为黄芩苷通过抑制TLR4/NF-κB信号通路抑制脂多糖炎症信号向细胞内传导，从而抑制其下游TNF-α、IL-6等炎症细胞因子的激活，通过抑制炎症反应的启动发挥对牙髓炎的抑制作用，保护牙髓细胞。

综上所述，黄芩苷具有抑制牙髓炎症反应的作用，其机制可能为黄芩苷通过抑制TLR4/NF-κB信号通路及其下游炎症细胞因子的激活从而抑制牙髓炎的炎症反应。