郭婷婷，齐婷娟，岳成，周玉柏，李霄

北京工业大学生命科学与生物工程学院，北京100124

流行病学调查显示，艾滋病仍然是一个重大的世界性公共卫生问题。2017 年全球共有1800万新发人类免疫缺陷病毒（human immunodeficiency virus，HIV）感染病例，94 万人死于与艾滋病相关的疾病[1]。高效抗逆转录病毒疗法（highly active antiretroviral therapy，HAART）又称为“鸡尾酒疗法”，是目前临床治疗艾滋病的首选疗法。虽然HAART 可显著降低HIV 滴度，延长患者生存时间，但同时也存在药物毒副作用大、费用昂贵，以及并不能有效清除体内HIV 等问题。因此，寻找更为高效且低毒性的新型抗艾滋药物是目前HIV 研究的热点[2]。

桦褐孔菌［Inonotus obliquus（Fr.）Pilat］是担子菌门、多孔菌科、纤孔菌属的真菌，主要分布于俄罗斯的西伯利亚、远东地区，日本的北海道地区，以及我国黑龙江省和吉林省长白山地区[3]。已有多项研究报道桦褐孔菌具有抗肿瘤、抗氧化、抗病毒、抗菌、降低弓形虫感染等药理作用，细胞毒性低，几乎无副作用[4-6]。其生物活性成分主要有多糖、羊毛甾醇型三萜类、桦褐孔菌醇和桦褐孔菌素、黑色素类、木质素类等[7-12]。有研究表明桦褐孔菌中含有的多糖类、三萜类等生物活性物质可以提高机体免疫功能，抑制HIV 蛋白酶，它还具有稳固细胞壁、阻碍病毒释放酶、阻止病毒在细胞壁上附着、抑制病毒的繁殖和复制等多种功能。黄纪国等[13]对桦褐孔菌抗病毒活性成分进行了分离、结构鉴定及抗病毒活性研究，为全面了解桦褐孔菌抑制疱疹病毒机理提供了科学依据。Ichimura 等[14]研究发现，桦褐孔菌水提取物中含有一种高分子木质素类衍生物，具有抑制HIV-1 蛋白酶的活性。然而，桦褐孔菌水提物抗HIV 的作用以及潜在的作用靶点目前研究得并不充分。

我们提取了桦褐孔菌粉末水提物，在此基础上对桦褐孔菌水提物的抗HIV-1 活性和潜在的作用靶点进行了研究，为进一步开发基于桦褐孔菌的新型抗HIV 药物奠定了实验基础。

1 材料与方法

1.1 材料

桦褐孔菌购自吉林省白山市；HEK-293T、TZM-bl 细胞，pVSVG-G 质粒，HIV-1 B 亚型全基因组病毒骨架质粒pSG3ΔEnv，包膜质粒SVPB16，HIV-1 整合酶均由本实验室保存；CCK-8 试剂购自东仁化学科技（上海）有限公司；质粒小提中量试剂盒购自天根生化科技有限公司；DNA 转染试剂Fugene HD、萤光素酶检测试剂盒购自Promega公司；反转录酶试剂盒（colorimetric）购自Roche 公司；DMEM 培养基、PBS 购自Gibco 公司；中草药粉碎机购自天津市泰斯特仪器有限公司；Rotavapor R-200 旋转蒸发仪购自Buchi 公司；全波长酶标仪购自Perkin Elmer 公司。

1.2 桦褐孔菌水提物的制备与纯化

称量桦褐孔菌粉末100 g，加入1000 mL 95%乙醇，回流提取2 次，用旋转蒸发仪减压至乙醇完全蒸发，药渣置于室温干燥，按料液比1∶15（g/mL）加去离子水煮沸（2 h/次，3 次），加乙醇，静置，抽滤，获得粗桦褐孔菌水提物。

称取5 g 粗桦褐孔菌水提物，加去离子水定容至50 mL，再加200 mL 无水乙醇，静置24 h，4000 r/min 离心10 min，取沉淀，依次用95%乙醇、无水乙醇、丙酮溶液洗涤3 次，6000 r/min 离心10 min，弃上清液，沉淀置于室温干燥后获得纯化的桦褐孔菌水提物。

1.3 细胞培养和假病毒制备

HEK-293T、TZM-bl 细胞用含10%胎牛血清（FBS）、100 μg/mL 青霉素和100 U/mL 链霉素的DMEM 培养基，于5% CO2、37℃培养箱中培养。制备病毒时，将293T 细胞在6 孔板中培养24 h，按质量比2∶1 加入骨架质粒pSG3ΔEnv和包膜质粒SVPB16，按1∶3 的转染比例与转染试剂混合后共转染293T 细胞，8 h 后更换完全培养基，培养48 h 后离心收集上清，即HIV-1 假病毒，测定半数组织培养感染剂量（TCID50）。

1.4 细胞毒性检测

采用CCK-8 法。将TZM-bl 细胞按7000/孔接种于96 孔板，桦褐孔菌水提物以12.5、25、50、100、200 μg/mL 的浓度设5 个梯度，每个梯度设3个复孔，每孔加入100 μL 不同浓度的桦褐孔菌水提物，对照组加入100 μL 完全培养基。培养48 h 后，每孔加入100 μL 用不含FBS 的DMEM培养基稀释的CCK-8 溶液，37℃孵育1 h，用酶标仪测D450nm值。根据下式计算水提物对TZM-bl 细胞的抑制率：

1.5 假病毒单轮感染活性试验

采用萤光素酶法检测。TZM-bl 细胞按6000/孔接种于96 孔板，培养24 h 后用含DEAE 的完全培养基稀释的病毒溶液感染细胞，每孔200 TCID50，感染的同时将浓度梯度稀释的桦褐孔菌水提物分别加到96 孔板中，每个梯度设3 个复孔，37℃孵育2 h，同时设置病毒对照组和细胞对照组（病毒对照组加入等体积的完全培养基和用含DEAE-纤维素的完全培养基稀释的病毒溶液，每孔200 TCID50；细胞对照组加入等体积的完全培养基和含DEAE-纤维素的完全培养基），培养48 h，弃去部分上清，每孔加入35 μL 裂解液，室温孵育15 min，用Promega 萤光素酶底物试剂盒处理样品，酶标仪测D450nm值。

用GraphPad Prism 6.0 软件对实验数据进行拟合处理，得到量效曲线和半数抑制浓度（IC50）。

1.6 VSV-G 包膜替换Env 包膜假病毒活性实验

通过检测桦褐孔菌水提物对水泡性口炎病毒糖蛋白（VSV-G）替换Env 包膜的HIV-1 与TZM-bl 靶细胞融合的影响来验证桦褐孔菌水提物对不同包膜的HIV-1 的抑制作用，具体方法同1.5，仅将1.5 方法中的Env 包膜的假病毒替换为VSV-G 包膜的假病毒。

1.7 体外逆转录酶、整合酶活性检测

用Reverse Transcriptase Assay 试剂盒体外检测桦褐孔菌水提物对HIV-1 逆转录酶活性的抑制作用。各孔加入稀释的桦褐孔菌水提物、HIV-1 RT 酶及反应混合液各20 μL，混匀后37℃孵育1 h。设立不加水提物只加RT 酶的阴性对照组和阳性对照组，阳性药选择奈韦拉平（NVP），试验浓度为10 μg/mL；孵育1 h 后转移至包被DNA（dUTP）的微孔板中，孵育1 h 后加入偶联抗-地高辛-过氧化物酶（Anti-DIG-POD）200 μL，继续孵育1 h，采用POD 底物（ABTS）显色，酶标仪测D405nm值，计算抑制率。

采用分子信标法[15]体外检测整合酶的活性。整合酶寡核苷酸底物序列及修饰标记为（FAM）-5′ACTGCTAGAGATTTTCCACGTGGAAAATCTCTAG CAGT-3′（DABCYL）。各孔加入20 μL 稀释的桦褐孔菌水提物、50 μL 反应缓冲液、2 μL DTT、2.5 μg 重组整合酶，双蒸水补足体积至100 μL。黄岑素作为阳性对照组，同时设只加整合酶不加药物的阴性对照组。混匀后37℃孵育30 min，分别加入2 μL Mn2+、4 μL 20 pmol/L 的DNA 底物，37℃避光孵育2 h，用酶标仪连续检测不同时间段每孔的相对荧光单位（RFU）。

1.8 时间递加分析实验

采用分时间点加药实验来确定病毒作用的潜在靶点。TZM-bl 细胞按6000/孔接种于96 孔板，37℃培养过夜，在病毒感染细胞后的0.15、0.3、1、2、6、9、24 h 分别加入浓度大于半最大效应浓度（EC50）10 倍以上的水提物。阳性对照组同时设4 组，分别加入1.0 μmol/L CCR5 受体拮抗剂马拉韦罗（maraviroc，MVC）、1.0 μmol/L 逆转录酶抑制剂齐多夫定（3'-azido-3'-deoxythymidine，AZT）、1.0 μmol/L 整合酶抑制剂拉替拉韦（raltegravir，RAL）、1.0 μmol/L 融合抑制剂恩夫韦肽（enfuvirtide，T-20），同时设加入同等体积DMEM完全培养基的细胞对照组和只加病毒溶液的病毒对照组，每组设3 个复孔，培养48 h 后采用萤光素酶法检测对病毒复制的抑制作用。

1.9 统计学处理

用GraphPad Prism 6.0 软件进行数据统计与做图，每个试验数据至少为3 次试验的均值±标准偏差（x±s），2 组间比较采用t检验，多组间用单因素方差分析，P＜0.05 认为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 细胞毒性检测

为确定桦褐孔菌水提物的细胞毒性及试验浓度，采用CCK-8 法检测不同浓度的桦褐孔菌水提物的细胞毒性。水提物对TZM-bl 细胞增殖的抑制作用具有明显的量效关系，半数毒性浓度（TC50）大于200 μg/mL，说明具有良好的安全剂量范围。以细胞抑制率≤10%时的剂量作为最大无毒剂量，最终选择25 μg/mL 作为试验的起始浓度（图1，P＜0.05）。

2.2 假病毒单轮感染活性试验

桦褐孔菌水提物对3 株不同包膜的HIV-1 均有抑制作用，病毒抑制率与水提物的浓度呈正相关。水提物对由骨架质粒pSG3ΔEnv和3 种不同Env包膜质粒制备的HIV-1 的IC50分别为12.17±2.085、5.661±1.058、8.846±1.334 μg/mL。结果表明水提物对HIV-1 均具有剂量依赖性的抑制作用（图1，P＜0.05）。

2.3 桦褐孔菌水提物抗VSV-G 包膜替换Env 包膜假病毒活性实验

桦褐孔菌水提物对不同包膜的HIV-1 有抑制作用，与阳性对照AZT 相比，桦褐孔菌水提物浓度为2.7～25 μg/mL 时，随着浓度的增大，对病毒的抑制作用越强，且桦褐孔菌水提物对Env 包膜的HIV-1 的抑制作用优于VSV-G 包膜的HIV-1（图2，P＜0.05）。

2.4 体外逆转录酶活性检测

0.65 、12.5、25 μg/mL 的桦褐孔菌水提物对HIV-1 逆转录酶活性均有抑制作用，抑制率分别为13.31%±3.39%、26.24%±5.6%、28.36%±4.3%。相比对照组，25 μg/mL 的桦褐孔菌水提物具有较显著的体外抗逆转录酶活性，提示桦褐孔菌水提物体可通过降低逆转录酶的活性而抑制HIV-1的复制（图3，***P＜0.001）。

2.5 体外整合酶活性检测

与对照组相比，桦褐孔菌水提物浓度为0.65和12.5 μg/mL 时的RFU 值与阴性对照组无显著性差异（P＞0.05），桦褐孔菌水提物浓度为25 μg/mL 时的RFU 与阴性对照组有显著性差异（P＜0.05），表明25 μg/mL 的桦褐孔菌水提物能有效抑制整合酶的活性（图4，***P＜0.001）。

2.6 时间递加分析实验

病毒感染后的前2 h 是病毒吸附和融合阶段，时间递加分析实验结果显示，桦褐孔菌水提物在加入早期具有较好的抑制HIV-1 效果，水提物与MVC 相比，二者具有相似的抑制曲线，说明桦褐孔菌水提物对病毒的吸附和融合阶段具有抑制作用（图5，P＜0.05）；病毒感染后2～4 h 是病毒逆转录过程，与阳性药物AZT 相比，水提物对病毒的抑制率明显降低。

3 讨论

图1 桦褐孔菌水提物对TZM-bl 细胞的毒性及体外抗HIV-1 活性（x±s，n=5）

本研究首先在分离提取桦褐孔菌水提物的基础上探讨桦褐孔菌水提物体外抗HIV-1 作用及潜在作用靶点。用CCK-8 法对桦褐孔菌水提物进行体外细胞毒性检测，并通过假病毒单轮感染活性实验评价水提物体外抗病毒活性，结果显示桦褐孔菌水提物对HIV-1 均具有剂量依赖性的抑制作用，具有良好的体外抗HIV-1 活性。

图2 桦褐孔菌水提物对VSV-G包膜替换Env包膜的HIV-1的抑制作用（x±s，n=5）

图3 桦褐孔菌水提物体外对逆转录酶活性的抑制作用（x±s，n=3）

图4 桦褐孔菌水提物体外对整合酶活性的抑制作用（x±s，n=3）

图5 时间递加分析实验（x±s，n=3）

为进一步研究桦褐孔菌水提物体外抗HIV-1的潜在靶点，我们开展了体外逆转录酶、整合酶活性检测，包膜替换的假病毒活性实验，以及时间点加药实验。据报道桦褐孔菌中的一种高分子木质素衍生物能够有效抑制蛋白酶活性[14]，我们的实验结果也证实桦褐孔菌水提物对HIV-1逆转录酶、整合酶活性均有抑制作用。然而，时间点加药实验结果显示，桦褐孔菌水提物在HIV-1 的融合/进入阶段呈现最高的病毒抑制活性，提示桦褐孔菌水提物最佳的抗HIV-1 靶点可能位于HIV 感染的早期阶段。

综上所述，本研究表明桦褐孔菌水提物具有体外抗HIV-1 活性，其潜在的作用靶点可能位于病毒的融合、逆转录、整合等阶段，而病毒的融合/进入阶段可能存在最佳的作用靶点。上述结果为基于桦褐孔菌水提物的新型抗艾滋病中药的进一步研究提供了实验基础。