金焕治 林 岳 陈大庆

脓毒症是一种复杂的全身炎症反应综合征，由感染引发，与多器官功能障碍综合征和危重症患者的死亡率相关[1]。急性肺损伤是脓毒症的常见并发症，在危重症患者中有很高的发病率和死亡率[2]。脓毒症急性肺损伤的特征是肺部炎症反应的过度激活，肺组织细胞凋亡及氧化水平升高[3]。盲肠结扎穿孔（CLP）脓毒症模型大鼠，抗氧化因子超氧化物歧化酶（SOD）显著下降，促炎因子白细胞介素6（IL-6）、转化生长因子-β（TGF-β）水平升高[4]。氧化酶-1（PON1）是一种以血清为基础的抗氧化剂、抗炎剂和解毒剂，与脓毒症的预后相关[5]。芍药醇是从传统中草药牡丹皮、白芍根和野山药中提取的一种成分，广泛参与免疫调节、抗炎、抗肿瘤和抗氧化等生理过程[6-7]。研究显示，芍药醇显著减轻急性肺损伤炎症细胞浸润和肺泡壁增厚，防止肺水肿[8]。本研究制备大鼠脓毒症模型，观察芍药醇对脓毒症急性肺损伤的保护作用，并探讨其作用机制。

1 实验材料

1.1 动 物 18 只健康雄性SD 大鼠（SPF 级）[浙江中医药大学动物实验中心，动物实验条件合格证号SYXK（浙）2018-0012，实验动物伦理批件号2018028]，体质量为（250±20）g，由浙江中医药大学动物实验中心在SPF 条件下饲养繁殖，动物饲养及实验操作严格遵守实验动物的使用和管理原则。饲养室温度在20～25℃，提供12h 光照、12h 黑暗的昼夜光变化。

1.2 药 品 芍药醇（中国成都瑞芬思生物科技有限公司，批号552-41-0，规格：20mg）；脂多糖（上海昂一生物科技有限公司，批号L26331，规格：50mg）。

1.3 主要试剂 高迁移率族蛋白B1（HMGB1，美国CST 公司，批号6893）、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-9（Caspase9，美国CST 公司，批号9504）、cleaved-Caspase9（美国CST 公司，批号9509）、B 细胞淋巴瘤/白血病-2 基因（Bcl-2，美国CST 公司，批号15071）和核转录因子2（Nrf2，美国abcam 公司，批号76062），肿瘤坏死因子-α（TNF-α）试剂盒（美国eBioscience公司，批号88-7324-77）、IL-6 试剂盒（美国eBioscience 公司，批号88-7064-22）、TGF-β 试剂盒（美国eBioscience 公司，批号88-50690-22），丙二醛（MDA）试剂盒（中国南京建成生物工程研究所，批号A003-1-2）、SOD 试剂盒（中国南京建成生物工程研究所，批号A001-3-2）、过氧化氢酶（CAT）试剂盒（中国南京建成生物工程研究所，批号A007-1-1）、总抗氧化能力（T-AOC）试剂盒（中国南京建成生物工程研究所，批号A015-1-2）。

2 实验方法

2.1 动物分组及给药 18 只健康雄性SD 大鼠按照随机数字表法分为对照组、模型组和芍药醇组，每组6 只。模型组大鼠腹腔注射10mg/kg 脂多糖制备脓毒症模型；芍药醇组大鼠腹腔注射10mg/kg 脂多糖2h后，尾静脉单次注射50mg/kg 芍药醇（浓度设置参考文献[8-9]）；对照组大鼠腹腔注射等量生理盐水。

2.2 大鼠肺组织氧化因子水平检测 造模24h 后，3%戊巴比妥钠腹腔麻醉处死大鼠，无菌操作下打开并暴露胸腔，取肺组织，制成组织匀浆，按MDA 试剂盒操作，分光光度计记录450nm 处吸光度，计算MDA 含量；按T-AOC 试剂盒操作，分光光度计记录520nm 处吸光度，计算T-AOC 酶活性；按CAT 测定试剂盒操作，分光光度计记录240nm 处吸光度，计算CAT 酶活性；按SOD 试剂盒操作，分光光度计记录550nm 处吸光度，计算SOD 含量。

2.3 大鼠肺组织TNF-α、IL-6、TGF-β 炎症因子水平检测 造模24h 后，3%戊巴比妥钠腹腔麻醉处死大鼠，无菌操作下打开并暴露胸腔，取肺组织，制成组织匀浆，采用ELISA 法分别检测各组大鼠肺组织TNF-α、IL-6、TGF-β 炎性因子水平。

2.4 大鼠肺组织蛋白检测 3%戊巴比妥钠腹腔麻醉处死大鼠，无菌操作下打开并暴露胸腔，取肺组织，提取组织蛋白，BCA 法进行蛋白定量，蛋白变性，进行聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE），转移到聚偏二氟乙烯膜（PVDF），转膜结束后，5%脱脂牛奶封闭常温孵育1h，按一抗浓度HMGB1（1：1000）、Caspase9（1：2000）、cleaved-Caspase9（1：2000）、Bcl-2（1：5000）、Nrf2（1：1000）和β-actin（1：10000），4℃孵育过夜，洗膜液洗3 次，每次10min，二抗浓度（1：10000）孵育1.5h，洗膜液洗3 次，每次10min，化学发光法（ECL）显影，凝胶成像系统检测HMGB1、Caspase9、cleaved-Caspase9、Bcl-2 和Nrf2 蛋白表达，以β-actin 为内参。

2.5 大鼠肺组织miRNA 检测 3%戊巴比妥钠腹腔麻醉处死大鼠，无菌操作下打开并暴露胸腔，取肺组织，Trizol 法提取组织总RNA，将提取的RNA 进行反转录合成cDNA，反转录的cDNA 作为模板加入合成的引物，进行PCR 检测，PCR 程序如下：37℃，15min；95℃，30s；95℃，5s，60℃，30s，40 个循环。为了计算每个目标基因的表达水平的差异，以U6 表达量为内参，采用2-ΔΔCt 计算miRNA 相对表达水平。miRNA引物均由宝生物工程（大连）有限公司合成，具体序列如下：miR-21-F：5'-GCGGCGGTAGCTTATCAGACTG-3'，miR-21-R：5'-ATCCAGTGCAGGGTCCGAGG-3'；miR-126-F：5'-TATTTTGAAGAGGTTTTTGGAAGG-3'，miR-126-R：5'-CCAAAACACACAACTAACTAAAAACAA-3'；miR-223-F：5'-ATGGTTCGTGGGTGTCAGTTTGTCAAAT-3'；miR-223-R：5'-GCAGGGTCCGAGGTATTC -3'；U6 -F：5' -CGCTTCGGCAGCCACATATACTA-3'，U6-R：5'-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCA-3'。

3 实验结果

3.1 各组大鼠肺组织MDA、T-AOC、CAT、SOD 水平比较 与对照组比较，模型组大鼠肺组织氧化应激水平显著升高，表现为MDA 水平显著提高，T-AOC水平显著下降，CAT 和SOD 活性减低，差异均有统计学意义（P＜0.05 或P＜0.01）；与模型组比较，芍药醇组大鼠肺组织T-AOC 水平升高，MDA 水平降低，CAT 和SOD 活性增强，差异均有统计学意义（P＜0.05或P＜0.01）。见表1。

表1 各组大鼠肺组织MDA、T-AOC、CAT、SOD 水平比较（）

表1 各组大鼠肺组织MDA、T-AOC、CAT、SOD 水平比较（）

注：与对照组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与模型组比较，△P＜0.05，△△P＜0.01；T-AOC：总抗氧化能力；MDA：丙二醛；CAT：过氧化氢酶；SOD：超氧化物歧化酶；模型组大鼠腹腔注射10mg/kg 脂多糖；芍药醇组大鼠腹腔注射10mg/kg 脂多糖+尾静脉单次注射50mg/kg 芍药醇；对照组大鼠腹腔注射等量生理盐水

3.2 各组大鼠肺组织TNF-α、IL-6、TGF-β 水平比较 与对照组比较，模型组大鼠肺组织炎症反应增强，表现为TNF-α、IL-6、TGF-β 浓度升高，差异均有统计学意义（P＜0.05 或P＜0.01）；与模型组比较，芍药醇组大鼠肺组织TNF-α、IL-6、TGF-β 浓度降低，差异均有统计学意义（P＜0.05 或P＜0.01）。见表2。

3.3 各组脓毒症急性肺损伤大鼠凋亡、氧化应激及炎症相关蛋白表达量比较 与对照组比较，模型组大鼠肺组织炎症反应、细胞凋亡及氧化应激通路激活，表现为Bcl-2 表达减少，Caspase9 蛋白发生剪切，cleaved-Caspase9 表达增加，炎症通路关键蛋白HMGB1 表达增加，Nrf2 表达减少。与模型组比较，芍药醇组大鼠肺组织Bcl-2 和Nrf2 蛋白表达增多，Caspase9蛋白发生剪切，cleaved -Caspase9 和HMGB1 蛋白表达减少。见图1。

表2 各组大鼠肺组织TNF-α、IL-6、TGF-β 水平比较（）

表2 各组大鼠肺组织TNF-α、IL-6、TGF-β 水平比较（）

注：与对照组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与模型组比较，△P＜0.05，△△P＜0.01；TNF-α：肿瘤坏死因子-α；IL-6：白细胞介素6；TGF-β：转化生长因子-β；模型组大鼠腹腔注射10mg/kg 脂多糖；芍药醇组大鼠腹腔注射10mg/kg 脂多糖+尾静脉单次注射50mg/kg 芍药醇；对照组大鼠腹腔注射等量生理盐水

图1 芍药醇调控凋亡、氧化应激及炎症相关通路蛋白表达

3.4 各组脓毒症急性肺损伤大鼠肺组织miRNA 水平比较 与对照组比较，模型组大鼠肺组织miR-126、miR-223 水平降低，miR-21 水平升高，差异均有统计学意义（P＜0.05 或P＜0.01）。与模型组比较，芍药醇组大鼠肺组织miR-126、miR-223 水平升高，miR-21 水平降低，差异均有统计学意义（P＜0.05 或P＜0.01）。见表3。

表3 各组大鼠肺组织miR-126、miR-223 及miR-21 水平比较（）

表3 各组大鼠肺组织miR-126、miR-223 及miR-21 水平比较（）

注：与对照组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与模型组比较，△P＜0.05，△△P＜0.01；miR-126：非编码单链小RNA 分子126；miR-223：非编码单链小RNA 分子223；miR-21 非编码单链小RNA 分子21；模型组大鼠腹腔注射10mg/kg 脂多糖；芍药醇组大鼠腹腔注射10mg/kg 脂多糖+尾静脉单次注射50mg/kg 芍药醇；对照组大鼠腹腔注射等量生理盐水

4 讨论

脓毒症死亡率和发病率的主要原因是由急性呼吸窘迫综合征（ARDS）引起的急性肺损伤。ARDS 主要由细胞促炎因子的释放、聚集的粒细胞和单核细胞进入肺，导致肺血管通透性增加，肺泡通气丧失引起[9]。除保护性机械通气外，目前尚无针对急性肺损伤的特异性、有效药物干预措施。

研究报道，氨基噻唑-芍药醇衍生物（APDs）作为一种强效抗炎剂，发挥抗炎作用，显著改善急性肺损伤和ARDs[10]。芍药醇抗炎和抗氧化功效已在牙周炎和皮炎等炎性疾病中被证实[11-12]。芍药醇通过调控Nrf2/核因子-κB（NF-κB）通路显著抑制牙周炎炎症反应和氧化水平[13]。含有芍药醇的润肤剂能显著改善小鼠特应性皮炎模型的皮肤含水量、pH 值和水分流失率，且无皮肤刺激[14]。基于芍药醇的功效，本研究发现，芍药醇显著抑制脓毒症急性肺损伤炎症反应、氧化应激和细胞凋亡，Western blot 结果表明，芍药醇可能通过HMGB1 调控炎症反应，Nrf2 调控氧化应激，Bcl-2 抑制细胞凋亡，但具体机制还需进一步探索。

miRNA 作为机体中广泛存在的非编码RNA，广泛应用于疾病诊断、预后及治疗策略。在一项实验性研究中，187 例脓毒症患者血浆miR-223 水平降低，且与疾病严重程度和炎症标志物水平相关，可能成为脓毒症患者新的诊断和预后标志物[15]。芍药醇通过刺激单核细胞来源的外泌体miRNA-223 来减轻内皮细胞的炎症反应[16]。本研究发现，芍药醇可显著升高肺组织miR-223 水平。敲除小鼠肾小管上皮细胞miRNA-21 可增加NF-κB 活性，降低Bcl-2 表达，加重脓毒症缺血引起的器官损伤[17]。本研究发现，芍药醇显著降低肺组织miR-21 水平，伴随Bcl-2 表达增加。升高miR-126 水平显著提高脓毒症大鼠的存活率[18]。miR-126 靶向抑制胰岛素受体底物1（IRS1）转录水平，促进参与糖异生和氧化应激抵抗的基因表达[19]。本研究发现芍药醇提高miR-126 水平，增加抗氧化蛋白Nrf2 表达，改变氧化因子水平。但芍药醇通过调控脓毒症miRNA 水平影响肺损伤的机制还需进一步研究。因此，芍药醇抑制脓毒症急性肺损伤炎症反应、氧化应激和凋亡，主要表现为氧化因子、炎性因子及相关蛋白和miRNA 改变，为芍药醇临床上治疗脓毒症提供理论依据。