卢裕强 郭汝宝

周围神经损伤是指周围神经神经干或分支受到损害后，引起躯体感觉障碍、运动功能减退等症状的一类病症，临床常见、多发[1]。但神经和骨骼肌变性萎缩的机理复杂，目前临床上对受损神经、肌肉的再生修复缺少有效的治疗手段[2]。推拿是中医重要组成部分之一，有疏通经络、舒筋止痛等功效，广泛应用于周围神经损伤、肌萎缩等疾病，取得较好的临床效果[3]。本课题组既往研究表明，推拿手法作用于骨骼肌失神经支配模型家兔，可改善患肌的肌电生理及收缩功能，延缓骨骼肌萎缩[4]。本次研究拟通过推拿手法作用于骨骼肌失神经支配家兔，观察骨骼肌失神经支配后肌组织成肌调节因子中生肌因子5（Myogenic factor 5，Myf-5）、肌细胞生成素（Myogenin）表达水平，研究推拿手法对失神经支配后骨骼肌萎缩修复的可能作用机制，报道如下。

1 实验材料

1.1 实验动物 2～3 月龄普通级新西兰雄性家兔120 只，由浙江中医药大学动物实验中心提供并饲养，每只体质量2～2.5kg，单笼饲养，自由进食，环境温度20～23℃，湿度30%～100%，光照150～200Lx，噪音小于50dB，许可证号：SCXK（浙）2015-0004。

1.2 试剂与仪器 注射用鼠神经生长因子（201412086，舒泰神生物制药公司）、Trizol Reagent（15596-026，美国Invitrogen 公司）、RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit（#K1622，美国Thermo 公司）、FastStart Universal SYBR Green Master（Rox）（04913914001，瑞士Roche 公司）、引物（美国Invitrogen 公 司）。Myf-5引物序列参数：上游5＇-GAGGGTGAGTTTGGGGACGA-3＇，下游5＇-TAGCGGATGGCATTCCTGAG-3＇；Myogenin 引物序列参数：上游5＇-CCACAACCTGCACTCCCTCA-3＇，下游5＇-CAGTTGGGCATGGTTTCATCG-3＇；内参GAPDH 引物序列参数：上游5＇-CGCCTGGAGAAAGCTGCTA-3＇，下游5＇-ACGACCTGGTCCTCGGTGTA-3＇。多样品研磨珠均质仪（Bead Ruptor 12，美国Omni 公司）、荧光定量PCR 仪（7300，美国ABI 公司）、超净工作台（SW-CJ-1FD，苏州苏净安泰公司）。

2 实验方法

2.1 动物分组及模型制备 新西兰家兔120 只适应性喂养1 周后，按随机数字表法分为正常对照组、模型对照组、神经生长因子（nerve growth factor，NGF）治疗组、手法治疗组，每组30 只。为了对检测指标做一连续动态观察，以及与本课题组既往研究相延续[4]，每组再随机分为五个亚组：2 周、3 周、1 个月、2 个月、4 个月组，每个亚组6 只家兔。模型对照组、NGF治疗组、手法治疗组家兔均进行右后肢胫神经切断操作，建立腓肠肌失神经支配模型[5]。具体操作：3%戊巴比妥钠溶液，家兔按0.7mL/kg 体质量，缓慢推注入耳缘静脉进行麻醉，将家兔在动物手术台上固定，右后肢剃毛并暴露大腿后部和腘窝。消毒后于膝上股后外侧切开小口，暴露并使用玻璃分针钝性分离胫神经，其后于胫神经上端处切断胫神经干，且将近端胫神经的游离断向上折返缝入股二头肌内。逐层缝合切口后，于切口附近注射青霉素预防感染。左后肢不做任何处理。正常对照组家兔仅于右后肢膝上股后外侧做同样大小切口，暴露胫神经，不做切断处理，消毒缝合切口同前。

2.2 干预措施（1）手法治疗组：推拿干预手法为按揉法，与本课题组既往的规范操作一致[4]。手法的轻重、频率均需通过FZ-I 型推拿手法测力分析仪标定，专人经训练之后，于手法组家兔术侧腓肠肌上进行操作。具体操作方法：家兔经兔用固定器固定，双后肢伸出，操作者一手固定其右下肢，暴露腓肠肌部位，另一手置于腓肠肌上，沿着腓肠肌走行，给予按揉手法操作。按揉法的参数：压力19.6N、频率140次/min，每次10min，每天1 次，于造模后第4 天开始进行手法干预。（2）NGF 治疗组：注射用鼠神经生长因子30μg 溶于2mL 注射用水后，家兔右后肢腓肠肌肌肉注射，于造模后第4 天开始，每天1 次，持续3周。正常对照组及模型对照组同样使用兔用固定器固定10min，但不进行其他操作。

2.3 指标检测 各亚组分别在各自对应的造模后第2 周、3 周、1 个月、2 个月、4 个月取材。（1）计算肌湿重比：将家兔过度麻醉后，沿股骨内外髁起点至跟骨结节止点完整剥取双侧腓肠肌，电子天平称量肌肉湿重，计算术侧与健侧的比值，即为肌湿重比。（2）实时聚合酶链反应（Real-Time PCR）法检测腓肠肌中Myf-5 mRNA、Myogenin mRNA 表达水平：快速取右后肢腓肠肌肌腹处1.0cm×1.0cm×0.5cm 肌肉组织1块，冷冻管内保存，液氨速冻后置于低温冰箱（-80℃）中保存。提取肌组织总RNA（标本排序；加入600μL Trizol 预冷；匀浆加入氯仿混匀；离心；取无机层，加入异丙醇混匀；离心后，弃上清液；用乙醇洗涤沉淀；离心3000r，2min，取沉淀；烘干；溶解RNA 保存），之后逆转录cDNA，将制备好的cDNA进行PCR 扩增，并计算Myf-5 mRNA、Myogenin mRNA 的相对表达量。采用仪器自带软件（ABI Prism 7000 SDS Software）记录分析数据。

3 结果

3.1 推拿手法对家兔失神经支配后腓肠肌肌湿重的影响 与正常对照组比较，模型对照组、NGF 治疗组、手法治疗组家兔各时间点腓肠肌肌湿重比均下降（P＜0.05）。NGF 治疗组在造模后第2 周、3 周、1 个月、2 个月，手法治疗组在造模后第2 周、3 周、1 个月、2 个月、4 个月时，腓肠肌肌湿重比高于模型对照组（P＜0.05）。手法治疗组在造模后第2 周、3 周时腓肠肌肌湿重比低于NGF 治疗组，4 个月时则高于NGF 治疗组（P＜0.05）。见表1。

3.2 推拿手法对家兔失神经支配后腓肠肌组织Myf-5 mRNA 表达的影响 模型对照组、NGF 治疗组、手法治疗组家兔各时间点腓肠肌Myf-5 mRNA表达均较正常对照组升高（P＜0.05）。NGF 治疗组在造模后第2 周、3 周、1 个月、2 个月，手法治疗组在造模后第2 周时，腓肠肌Myf-5 mRNA 表达低于模型对照组；手法治疗组在造模后第1、2、4 个月时，腓肠肌Myf-5 mRNA 表达高于模型对照组（P＜0.05）。手法治疗组在造模后第3 周、1 个月、2 个月、4 个月时，腓肠肌Myf-5 mRNA 表达高于NGF 治疗组（P＜0.05）。见表2。

3.3 推拿手法对家兔失神经支配后腓肠肌Myogenin mRNA 表达的影响 模型对照组、NGF 治疗组、手法治疗组家兔各时间点腓肠肌Myogenin mRNA 表达均较正常组升高（P＜0.05）。NGF 治疗组在造模后第2 周、3 周、1 个月、4 个月，手法治疗组在造模后第4 个月时，腓肠肌Myogenin mRNA 表达低于模型对照组，手法治疗组在造模后第2 个月时高于模型对照组（P＜0.05）。干预2 周、3 周、1 个月、2 个月后，手法治疗组腓肠肌Myogenin mRNA 表达均高于NGF 治疗组（P＜0.05）。见表3。

表1 各组失神经支配家兔腓肠肌肌湿重比比较（%，）

表1 各组失神经支配家兔腓肠肌肌湿重比比较（%，）

注：与正常对照组比较，*P＜0.05；与模型对照组比较，△P＜0.05；与NGF 治疗组比较，▲P＜0.05；模型对照组、NGF 治疗组、手法治疗组家兔均进行右后肢胫神经切断操作，手法治疗组进行推拿干预，NGF 治疗组肌注注射用鼠神经生长因子；NGF：神经生长因子

表2 各组失神经支配家兔腓肠肌组织Myf-5 mRNA 相对表达量比较（）

表2 各组失神经支配家兔腓肠肌组织Myf-5 mRNA 相对表达量比较（）

注：与正常组比较，*P＜0.05；与模型对照组比较，△P＜0.05；与NGF 治疗组比较，▲P＜0.05；模型对照组、NGF 治疗组、手法治疗组家兔均进行右后肢胫神经切断操作，手法治疗组进行推拿干预，NGF 治疗组肌注注射用鼠神经生长因子；NGF：神经生长因子；Myf-5：生肌因子5

表3 各组失神经支配家兔腓肠肌组织Myogenin mRNA 相对表达量比较（）

表3 各组失神经支配家兔腓肠肌组织Myogenin mRNA 相对表达量比较（）

注：与正常对照组比较，*P＜0.05；与模型对照组比较，△P＜0.05；与NGF 治疗组比较，▲P＜0.05；模型对照组、NGF 治疗组、手法治疗组家兔均进行右后肢胫神经切断操作，手法治疗组进行推拿干预，NGF 治疗组肌注注射用鼠神经生长因子；NGF：神经生长因子；Myogenin：肌细胞生成素

4 讨论

失神经支配之后骨骼肌萎缩较迅速，而神经再生较缓慢，往往骨骼肌在神经再支配前已基本丧失细胞再生的物质基础，导致神经修复后肌肉功能难以恢复[6]。因此，保存失神经支配骨骼肌的再生活性，防止其不可逆变性萎缩，是解决失神经支配骨骼肌重获神经支配后有效功能康复的重要环节[7]。

研究发现，周围神经损伤后，局部组织通过推拿手法干预，发生了一系列关节、肌肉的被动运动，一方面促进了局部的淋巴、血液循环，改善组织炎性水肿、瘢痕粘连，从而防止被损伤肌肉、韧带、关节囊的挛缩[8]；另一方面，通过有规律被动性收缩，局部肌肉兴奋，肌组织代谢增强、有害代谢物堆积减少，从而改善失神经后萎缩的骨骼肌组织的代谢过程，同时也促进了一系列肌源性生物活性物质的产生及骨骼肌再生分化，使肌组织纤维化进程得到控制，延缓废用性萎缩的发生[9-10]。与此同时，骨骼肌再生是一个大量神经生长因子、细胞因子等共同参与的高度动态调控过程，其中NGF 是最早被发现，也是非常典型的一种神经营养因子，是目前临床上周围神经损伤后常用的内科治疗手段，在临床及科研上均取得了一定的疗效[11-12]，因此本实验也将NGF 作为手法治疗的一个对照。

周围神经重度损伤后其支配的骨骼肌迅速萎缩并失去收缩功能，最突出的症状是肌肉萎缩；肌湿重是实验中常用于观察骨骼肌萎缩情况的一项宏观指标。以往本课题组的研究观察到，周围神经切断损伤后，相关骨骼肌肌湿重迅速出现下降，随着损伤时间延长而下降速度趋缓[13]。本研究同样观察到，与正常对照组相比，模型对照组干预2 周时，腓肠肌肌湿重比已下降显著（P＜0.05），表明家兔行胫神经切断术后，腓肠肌失去神经支配，萎缩明显，达到了我们研究时需要观察损伤神经修复与萎缩骨骼肌修复两个方面的需求；3 周后肌湿重比下降趋势变缓，与既往研究相近。与模型对照组相比，NGF 及手法治疗组各时间点肌湿重比值为高（P＜0.05），表明经NGF、推拿手法干预可减轻失神经骨骼肌的萎缩。另一方面，手法治疗组4 个月时显著高于NGF 治疗组（P＜0.05），这表明手法治疗的远期疗效好于NGF 治疗。

肌卫星细胞是骨骼肌再生的关键。肌卫星细胞的增殖、激活、成肌分化受到成肌调控因子、生长因子、激素等多因素的影响[14]。其中成肌调节因子由Myogenin、Myf-5、肌分化因子（MyoD）等组成[15]。其中肌卫星细胞的活化、增殖和分化主要受骨骼肌特异性转录因子Myogenin 等的调节，与Myogenin 参与成肌细胞融合、形成肌管的过程有关[16-17]。而Myf-5 属成肌决定因子，位于Myogenin 的上游，主要存在于静止期的肌卫星细胞，肌组织受损后，静默状态的肌卫星细胞开始激活并表达Myf-5，从而促进肌卫星细胞表达并自我激活和相互激活，具体可能与调节肌纤维的生长相关[18]。

本实验结果表明，骨骼肌失神经损伤后，肌组织的Myf-5 和Myogenin 含量均早期开始升高，表明Myf-5 和Myogenin 早期参与了骨骼肌失神经支配损害后的动态调控，与其他学者研究一致[19-20]。NGF 治疗组Myf-5 和Myogenin mRNA 表达在各时间点均低于模型对照组，而肌湿重在中远期改善均明显，可能与通过外源性提供NGF 而促进神经轴突生长、神经再支配有关，从而改善肌萎缩相关，与既往他人研究失神经支配后肌组织内NGF 开始显著下降，通过外源性提供NGF 可改善神经及肌组织功能一致[21]。手法治疗组Myf-5 mRNA 在2 周低于模型对照组，第3 周显著升高，在1、2、4 个月高于模型对照组，表明手法在早期抑制Myf-5 表达，中期开始促进其表达，Myogenin mRNA 在2 个月高于模型对照组，在4个月低于模型组，表明推拿手法可以促进Myogenin mRNA 在后期的表达。而Myogenin 位于Myf5 的下游，既往研究表明，myogenin 表达升高有利于骨骼肌接受神经再支配，在接受神经再支配后骨骼肌功能恢复较良好[22]。结合既往本课题组发现手法治疗可促进肌卫星细胞的成肌分化，以及本次手法在早中期改善Myf-5 表达峰期，后期改善Myogenin 表达[23]。这提示手法干预可能使得Myf-5 表达高峰后延且后期持续增高，从而避免肌卫星细胞的早期非神经性无效增殖，而在后期Myogenin 的显著升高，也更为骨骼肌的再生保留了活力。这种机制与NGF 改善失神经骨骼肌萎缩的机制存在不同，因此也可解释为何手法组及NGF 组均取得了疗效，但对于Myf-5、Myogenin 的改变却不相同。

综上所述，推拿手法改善成肌调节因子Myf-5、Myogenin 的表达可能是手法改善失神经支配骨骼肌功能的机制之一，但推拿手法对于延缓肌萎缩的具体作用靶点仍需未来进一步研究。