朱智慧，晁二昆，钱广涛，孙伟，薛建平*，师玉华，3*

1.淮北师范大学 生命科学学院，安徽 淮北 235000；2.中国中医科学院 中药研究所，北京 100700；3.中国中医科学院 青蒿素研究中心，北京 100700

药用植物在植物资源中占据了相当重要的地位，是中医药传承和发展的物质基础和宝贵财富，有着巨大的市场潜力。我国药用植物种类繁多，《神农本草经》《本草纲目》等古籍中记载了大量药用植物发现和使用的历史。药用植物中产生的次生代谢产物包括生物碱、萜类、黄酮类、有机酸、木质素等，具有很好的药用或保健价值，因此市场需求量非常大。如黄花蒿Artemisiaannua中的青蒿素，是治疗疟疾的一线药物，已在全球范围内使用并挽救了数百万人的性命。然而，药用植物中的天然次生代谢产物含量一般较低，合成不稳定，且由于长期开发利用，野生药用资源破坏严重，导致可持续利用的资源日趋减少，有些珍稀物种甚至濒临灭绝，因此亟需寻求有效的可持续植物天然产物合成手段[1]。

毛状根(hairy roots)又称发状根，是指利用发根农杆菌Agrobacteriomrhizogenes侵染植物后，其Ri质粒的转移脱氧核糖核酸(T-DNA)区整合进植物细胞核基因组，诱导植物细胞产生的一种冠瘿组织[2]。早在1982年，Chilton等[3]就报道利用发根农杆菌感染植物能够产生毛状根。研究发现，发根农杆菌能侵染并诱导几乎所有的双子叶植物、少数单子叶植物以及个别裸子植物产生毛状根。与传统植物栽培、组织培养等技术相比，毛状根培养具有激素自主性、生长周期短、次生代谢成分积累能力强且稳定、能合成新化合物、生长繁殖能力快等优点，因此被广泛应用于药用植物的基础研究和应用领域[4]。

1 药用植物毛状根研究体系

药用植物毛状根研究体系是利用发根农杆菌诱导药用植物产生毛状根，研究药用植物次生代谢产物生产、基因功能验证和种质资源改良与繁育等的方法体系，是药用植物分子遗传学研究的重要手段之一[5]。本文从药用植物毛状根的诱导方法、影响毛状根诱导的主要因素和毛状根的鉴定方法等方面系统介绍了药用植物的毛状根研究体系(图1)，为药用植物的毛状根诱导研究提供参考。

1.1 毛状根的诱导方法

不同药用植物，选择的毛状根诱导方式也不尽相同。根据转化受体的不同，毛状根的诱导方法分为：外植体共培养法、直接感染法和原生质体共培养法。在实际应用中以外植体共培养法为主，主要步骤分为：1)外植体的准备。外植体的选择对于药用植物的毛状根诱导至关重要。同一药用植物的不同部位与不同植物的相同部位诱发毛状根的频率均有差异。一般来说，在诱导毛状根的过程中，采用幼嫩的叶片、茎或叶柄作为外植体组织进行转化。2)农杆菌的侵染。Ri农杆菌的类型和菌的活力是毛状根诱导效率的重要影响因素。转化时，选择适合药用植物的Ri农杆菌类型，并将保存好的菌株在固体培养基上活化2次，随后转接至液体培养基中培养至菌吸收度A600值为0.5左右，以确保菌的活力，再用MS培养基悬浮菌体至适宜的吸收度A600值(根据不同药用植物，0.1～0.5不等)，然后再用活化好的农杆菌悬浮液浸染准备好的无菌的外植体15～20 min。3)共培养。将浸染后的外植体吹干，放置在共培养培养基中，于25 ℃黑暗环境下共培养2～3 d。4)除菌诱导培养。将共培养后的外植体移至除菌诱导培养基上(MS+400 mg·L-1头孢霉素)，每2周更换一次培养基，一般药用植物大约2～4周即可观察到毛状根的产生。5)毛状根的扩繁：待诱导出的毛状根长至2 cm左右，剪取生长状态良好的毛状根于液体MS培养基中，25 ℃，120 r·min-1摇床中扩繁，约每10 d收集继代一次。丹参Salviamiltiorrhiza[6]、冬凌草Rabdosiarubescens[7]等药用植物毛状根诱导均采用该方法。此外，直接注射法是将发根农杆菌直接注射活体无菌苗的茎、叶或者感染其伤口后诱导毛状根，如何首乌Fallopiamultiflora[8]。与外植体共培养法相比，直接感染法易操作更简单，但其诱导率相对较低。同时也有些药用植物采用原生质体共培养的方法诱导毛状根，如胡诚等[9]用纤维素酶和果胶酶处理人参Panaxginseng根愈伤组织获取原生质体，并使用发根农杆菌侵染共培养后得到人参毛状根。

图1 药用植物毛状根研究体系

1.2 影响毛状根形成的因素

毛状根的诱导是一个连续的过程，不同的外植体、菌株、诱导部位、培养基以及诱导方法对毛状根的产生和诱导效率均有影响[10]。

1.2.1 外植体类型 不同药用植物毛状根的诱导效率不同。双子叶植物被认为是农杆菌的传统受体，因此在发根农杆菌诱导植物产生毛状根中双子叶植物占多数。由于宿主因素限制，发根农杆菌诱导的单子叶植物和裸子植物起步晚，所以单子叶植物和裸子植物占少数。大部分的双子叶药用植物如人参、丹参、菘蓝Isatisindigotica、西洋参Panaxquinquefolius、黄花蒿和长春花Catharanthusroseus等均能成功诱导毛状根[11]；单子叶药用植物中的石斛Dendrobiumnobile、水母雪莲Saussureamedusa、露水草Cyanotisarachnoidea、栝楼Trichosantheskirilowii等和裸子植物的短叶红豆杉、红豆杉、银杏等也均有毛状根的研究报道。另外，同一种植物不同部位分化出毛状根的频率也不同。如苦荞Fagopyrumtataricum毛状根诱导过程中子叶分化出毛状根的频率明显高于下胚轴。幼嫩的外植体细胞处于旺盛的分裂状态，更易接受外源DNA，因此外植体一般选择苗期的幼嫩组织。

1.2.2 发根农杆菌的类型与活力 农杆菌诱导毛状根产生的能力与菌中的Ri质粒类型有关。Ri质粒将发根农杆菌主要分为四类：黄瓜碱型、甘露碱型、农杆碱型、米奇矛型。不同发根农杆菌对植物诱导毛状根的能力也是大不相同的。有研究利用5种发根农杆菌(ATCC31798、ATCC43057、AR12、A4和A13)诱导黄金果Solanummammosum，虽均有毛状根的产生，但AR12和A13诱导产生毛状根最早，A4和A13诱导率最高[12]。目前主要采用的发根农杆菌主要有ACCC10060、R1000、R1500、1855、8196、R1601、LBA9402和R1200等。此外，发根农杆菌的活性与浸染时菌液的浓度(吸收度A600值)对毛状根的转化效率也有着很大影响。

1.2.3 转化过程及培养条件 毛状根的每一个转化过程都对其转化效率具有一定影响。研究表明，外植体的预培养可促进细胞分裂，提高外源基因的瞬时表达和转化率，对外植体起到驯化作用。同时预培养可使外植体提前适应离体条件的培养。不同预培养时间也存在一定的差异[12]。外植体经预培养达到最佳状态可提高转化效率，但时间过长并不利于农杆菌的感染。另外，超声辅助、共培养时间、外源诱导物乙酰丁香酮(Acetosyringone)、抗生素的浓度等均影响毛状根的诱导效率[13-16]。物理因素如光照、培养温度、pH值等也是影响毛状根形成的因素之一。因此，实际应用中只有结合药用植物的自身特点，优化转化过程中的众多因素，才能摸索出植物最佳的毛状根诱导体系。

1.3 药用植物毛状根的鉴定

经发根农杆菌感染植物产生的毛状根均由一个细胞发育而来，具有很强的遗传稳定性。鉴定毛状根是否由发根农杆菌感染后产生，方法主要由形态鉴定、抗性鉴定、基因鉴定和报告基因鉴定。

1.3.1 形态学鉴定 毛状根与正常植物根系在形态上有明显的差异。首先，经发根农杆菌感染产生的毛状根可在无激素的培养基上迅速生长，呈白色并具有白色绒毛、多根毛、多分枝和失去向地性等正常根系不具有的特点，其次毛状根在液体培养基中生长速度大于正常根。这些特殊的形态为鉴别毛状根提供了有力的依据。

1.3.2 抗性筛选 若Ri质粒上携带有外源抗性基因，经发根农杆菌介导转化植物后会产生带抗性的毛状根，则可通过在毛状根诱导培养基中添加一定浓度的抗生素来筛选阳性毛状根。目前常用于植物遗传转化载体中的抗性基因有卡那霉素(kanamycin)和潮霉素(hygromycin)等。

1.3.3 报告基因检测 为了更为直观、快速地鉴定毛状根，研究人员在Ri质粒的T-DNA区插入GFP、GUS等报告基因，这样可以直接通过观察荧光、GUS染色反应等来鉴定阳性的毛状根，可用于阳性毛状根的早期鉴定[17]。

1.3.4 基因鉴定 提取毛状根基因组DNA，设计特异引物，通过聚合酶链式反应(PCR)扩增Ri质粒中的冠瘿碱合成基因，或者外源基因、目的基因和报告基因，然后通过琼脂糖凝胶电泳观察目标DNA片段，直接从基因水平鉴定阳性的毛状根。

2 药用植物毛状根的应用

目前，能够成功诱导毛状根的药用植物已不下百种。毛状根研究体系已经被广泛应用在药用植物的次生代谢产物生产、基因功能验证和种质资源改良与繁育等方面。

2.1 次生代谢产物生产

植物次生代谢产物是由植物次生代谢产生的一类非植物生长发育所必需的小分子有机化合物。药用植物中次生代谢产物种类繁多，是天然药物和化工原料的重要来源，有着重要的药用价值和经济价值。当前研究发现的次生代谢产物有生物碱、萜类、苯丙素类、醌类、黄酮类、鞣质类、甾体及其苷类[18]。目前，药用植物次生代谢产物生产的几种主要途径有：植物提取、化学合成、微生物发酵、植物组织和细胞培养以及基因工程等[19]。毛状根的培养是一种在80年代发展起来的基因工程和细胞工程相结合的技术，具有生长迅速、周期短、激素自主、遗传稳定性强且具有完整的代谢通路等优势，已经发展成为高效、稳定的药用植物次生代谢产物生产手段。目前，利用毛状根体系已经实现多种具有药用价值的次生代谢产物的生产，如黄酮类、生物碱类、蒽醌类、皂苷类、萜类等(表1)。

提高药用植物毛状根中次生代谢产物含量的途径主要有两种：一方面可通过改变毛状根培养的外在因子，有效刺激其体内次生代谢产物的积累。植物产生次生代谢产物本身就是为了抵御外界环境，因此通过改变毛状根培养的光、温、pH等环境因子、添加植物激素及内生菌、改变培养基配方等均可有效促进药用植物毛状根中次生代谢产物的积累。王瑜等[20]研究发现利用水杨酸、茉莉酸甲酯、酵母提取物3种生物诱导子对王不留行Vaccariasegetalis毛状根进行处理，能够明显促进其黄酮苷的产生；三七Panaxnotoginseng毛状根中含有大量三七皂苷，在24 ℃条件下培养，皂苷产量值最大[21]；在决明Cassiatora毛状根的培养基中添加0.05% NAA可使5种蒽醌类化合物的总和提高4倍，并且黑曲霉和茉莉酸诱导子均可促进蒽醌类化合物的形成[22]。另一方面调控毛状根内在遗传因素，将毛状根技术和基因重组技术联用，在Ri质粒中引入外源基因，通过激活目标产物代谢流或者抑制非药用成分合成的通路，增加毛状根中次生代谢产物合成效率。例如在药用植物虎杖Polygonumcuspidatum中，构建白藜芦醇合酶(Resveratrol Synthase，RS)基因的过表达载体，其转基因毛状根中的白藜芦醇含量显著提高，是对照组的4倍[23]；转化甘草鲨烯合成酶基因后的甘草Glycyrrhizauralensis毛状根比野生型中甘草酸含量提高3.6倍[24]；将嗜酸菌Ralstoniaeutropha中提取的3个基因导入甜菜Betavulgaris毛状根基因组，可促进其聚3-羟基丁酸酯的积累[25]。

表1 药用植物毛状根生产次生代谢产物

毛状根的大规模生产使其成为生产药用植物次生代谢产物的一种有效途径。1986年，Rhodes等[26]首次利用简易的喷气式容器培养毛状根，为利用毛状根生产次生代谢产物奠定了工业化基础。随着生物反应器的发展，用于毛状根扩大培养的生物反应器主要有气升式反应器、气泡柱反应器、搅拌槽反应器、滴流床反应器、营养雾反应器、喷雾反应器等，为生产不同代谢产物的多种药用植物毛状根的扩大培养奠定了基础。据Khan等[27]统计，有长春花、人参、丹参、紫草Lithospermumerythrorhizon、西洋参、甜菜、黄花蒿、甘草、黄芪Scutellarialateriflora、印度苦楝Azadirachtaindica等30多种药用植物用于扩大培养的研究与工艺改良。药用植物毛状根技术在次生代谢产物生产中的成功应用和规模量产为提供可持续利用的植物天然产物提供了技术支撑。

2.2 药用植物基因功能验证

毛状根体系作为常用的天然植物遗传转化体系之一，具有遗传稳定，生长条件可控等优势，是药用植物基因功能验证和基础研究的理想平台之一。以药用植物丹参为例，丹参酮是具有显著药理活性的二萜化合物，成熟的毛状根体系在研究丹参酮生物合成途径的关键基因和解析其代谢通路中发挥了重要的作用，也使得丹参成为药用植物的模式研究物种之一[40]。例如在转录水平研究上：Guo等[41]在银离子Ag+处理的丹参毛状根转录组中筛选出6个CYP450，经鉴定发现CYP76AH1能够催化次丹参酮二烯合成铁锈醇；高伟等[42]组合酵母提取物和Ag+诱导丹参毛状根，结合代谢组和转录组研究了丹参酮类有效成分形成的分子机制和候选基因的发掘，发现70个转录因子参与了应激反应，有8个CYP450可能参与丹参酮下游的生物合成。在关键酶基因功能验证研究中：Cheng等[43]利用RNAi干扰技术在丹参毛状根中减低SmCPS(copalyldiphosphate synthase)的表达，导致丹参酮水平降低，证实了SmCPS是丹参酮生物合成的关键酶基因；Ma等[44]在丹参毛状根中沉默CYP76AH1，证实该基因在丹参酮生物合成中起关键作用，丰富了丹参酮的合成与调控机制研究。此外，SmDXR[45]、SmJAZ8[46]、SmMYB9b[47]等基因的功能也在丹参毛状根中被成功验证。近几年以毛状根作为研究体系研究基因功能与分子机制的药用植物还有何首乌、苦荞、硬紫草、颠茄、甘草、北柴胡等[48]。例如：朱宽鹏[49]在何首乌毛状根体系中过表达和RNAi技术研究芪合酶基因(FmSTS)，结果表明二苯乙烯苷含量差异较大，证实FmSTS是二苯乙烯苷合成代谢的主要合成酶基因；张栋等[29]在红光和蓝光处理苦荞苗中发现MYB家族转录因子FtMYB116，将其转入苦荞毛状根后发现芦丁和槲皮素积累显著增加。毛状根体系出现成为研究基因功能和分子机制的热点。因此，毛状根技术为在药用植物功能研究与次生代谢产物合成调控机制解析提供了有效的遗传转化手段，为药用植物分子遗传学的深入研究奠定了基础。

2.3 药用种质资源改良与繁育

药用植物次生代谢产物丰富，但往往含量较低，不能满足市场日益剧增的需求。因此，高药效成分的药用植物品种改良迫在眉睫。毛状根由于其具有很强的再生能力且遗传稳定，为培育高药效物质药用植物品种提供了一种新方法。目前，能够通过毛状根再生出植株的药用植物有长春花、香石竹、蓝猪耳、雪莲、白英、紫苏、魔芋、蕺菜、桔梗、板蓝根等。因此，可利用基因工程技术获得目标代谢产物高的毛状根，进而通过毛状根再生体系，培育优质药用植物新品种。例如，长春花可以产生100多种具有很高药用价值的萜类吲哚生物碱，龚一富等[11]建立长春花毛状根再生植株快速繁育体系，筛选获得的长春花毛状根再生植株可促进抗癌生物碱的合成，此方法加速了长春花的品种改良；木本曼陀罗是莨菪烷类生物碱的资源植物，经基因技术改造后由曼陀罗毛状根再生植株的莨菪碱和东莨菪碱含量高于自然生长中的木本曼陀罗[50]；白英作为一种抗癌中草药，能够产生一种重要的药用成分薯蓣皂苷元，白英的毛状根和毛状根分化的再生植株中薯蓣皂苷元均有提高[51]；北玄参以根入药，富含许多天然生物活性物质，同样可诱导毛状根产生再生植株[52]。因此，利用基因工程技术改造后的毛状根再生植株表现出的高产和优质性状，对培育药用植物新品种具有重大意义。另外，毛状根根尖繁殖力强，生长迅速，可在短时间内获得大量遗传性一致的再生植株，也被用于药用植物的种质快繁与保存。一些生长周期较长的药用木本植物如丹参，木本曼陀罗、茶树等也可通过毛状根获得再生植株[7，51，53]。此外，也有研究报道用海藻酸钠凝胶包裹辣根Armoraciarusticana毛状根切段可制成人工种子，用于种质保存[54]。

3 展望

我国药用植物资源丰富，是天然药物的重要原料来源。然而，药用植物的基因研究起步较晚，很多药效成分物质的合成途径和调控机制尚不清晰，制约了药用植物资源的可持续发展。毛状根转化系统因其具有遗传稳定、生长迅速、激素自养、可有效提高药用活性成分含量等优势，在药用植物的基因功能研究和药用活性成分生产方面有着巨大的应用潜力。

3.1 药用植物基因功能研究

随着本草基因组学的发展，人参、三七、罂粟、穿心莲、丹参等一些重要的中草药基因组陆续发布[55]，药用植物的基因组、转录组、代谢组、蛋白组等组学信息得到极大丰富，为药用植物的分子遗传学研究提供了契机[56]。如何综合利用好组学数据，深入挖掘药用植物的次生代谢产物合成与调控、抗性机制等成为药用植物分子遗传学研究的核心问题[5]。遗传转化技术是植物基因功能研究和验证的重要技术之一。由于很多药用植物的植株再生技术不尽成熟，由根瘤农杆菌Ti介导的植株转化技术在药用植物上的应用较少，而由发根农杆菌Ri质粒介导的毛状根技术在药用植物研究应用中较多，是目前药用植物转基因功能研究的主要技术之一。解析与药用活性成分合成密切相关的代谢途径是药用植物基础研究的热点，毛状根转化体系作为药用植物基因功能验证的重要手段之一，在解析药用活性成分合成中的关键酶、代谢通路以及其调控机制研究中发挥重要作用。

3.2 药用活性成分生产

植物天然产物市场需求日益增长，现有药用植物资源已经供不应求，且药用植物中的次生代谢产物的含量往往偏低，难以满足工业化的需求。毛状根培养系统因其是天然植物系统，是次生代谢产物合成的天然工厂，已经成功用于多种次生代谢产物的生产。日前，研究人员利用植物代谢工程，即通过基因工程的技术，改变植物代谢流甚至重构新的代谢途径，从而提高植物中目标药效成分物质的含量。例如近期的研究中，德国多特蒙德技术大学的研究人员Jansing等[57]就利用CRISPR/Cas9基因编辑技术敲除烟草中的6个糖基转移酶基因，使其尼古丁含量减少99.7%。因此，随着药用植物次生代谢生物合成和调控机制研究的深入和毛状根培养生物反应器的日益成熟，综合运用代谢工程和外在因子诱导技术，毛状根有望成为次生代谢产物的生产“工厂”，用于药用植物活性成分的大规模生产，这不仅能够有效缓解天然产物的市场供求压力，且对药用植物资源的可持续利用具有深远意义。