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枇杷叶HPLC特征图谱研究及主要成分含量测定△

2019-12-24顾生玖李鹤周艳林邹节明林昆陈镜任朱开梅

中国现代中药 2019年11期
关键词:枇杷叶项下金丝

顾生玖,李鹤,,周艳林,邹节明,林昆,陈镜任,朱开梅*

1.桂林医学院 药学院,广西 桂林 541004;2.桂林三金药业股份有限公司,广西 桂林 541004

枇杷叶为蔷薇科植物枇杷Eriobotryajaponica(Thunb.)Lindl.的干燥叶,又名巴叶、芦桔叶,具有清肺止咳,降逆止呕的功效,主治肺热咳嗽、气逆喘急、胃热呕逆、烦热口渴等症[1-3]。广泛分布于我国大部分地区,全年均可采收。枇杷叶含有黄酮类、三萜酸类、倍半萜类、有机酸类及多糖类[4]等成分,目前对枇杷叶品质的评价方法比较单一,通常以枇杷叶中三萜酸的含量作为评价指标,缺乏整体性评价。文献报道黄酮苷类成分具有较多的药理活性[5-6],且又是枇杷叶的主要成分,因此开展了枇杷叶药材水溶性部位HPLC特征图谱的研究,并对其中金丝桃苷和槲皮苷进行含量测定,为枇杷叶药材及其复方制剂质量控制提供参考。

1 材料

1.1 仪器

1260系列高效液相色谱仪,含在线真空脱气机(G-1311C)、二元泵(G-1311C)、标准自动进样器(G-1329B)、智能化柱温箱(G-1316A)、DAD检测器(G-4212B)、Agilent1260 Infinity色谱工作站(美国安捷伦公司);Milli-Q Direct 8超纯水一体化系统(美国默克密理博公司);XP404S型电子天平(瑞士Mettler公司)。

1.2 试药

绿原酸(批号:110753-201415,纯度96.2%)、金丝桃苷(批号:111521-201004,纯度98.0%)、异槲皮苷(批号:111809-201403,纯度98.0%)、槲皮苷(批号:111538-201105,纯度:98.0%)均由中国食品药品检定研究院提供。乙腈为色谱纯(德国Merck公司);水为超纯水;其他试剂均为分析纯;MCI GEL CHP 20填料购自日本三菱化学公司。

实验用的新鲜枇杷叶采自广西桂林,采集时间为2018年5月。采摘新叶(淡绿色且质地较软)300 g、成熟叶(绿色且质地适中)300 g、老叶(墨绿色且质地较硬)300 g、落叶(自然掉落的黄叶)300 g,自采药材于60 ℃烘干,粉碎成粗粉。10批枇杷叶药材购自于桂林中南药业有限公司,经钟小清高级工程师鉴定为蔷薇科常绿小乔木植物枇杷Eriobotryajaponica(Thunb.)Lindl.的叶,批号分别为160101(S1)、160501(S2)、160701(S3)、160901(S4)、161001(S5)、161101(S6)、161201(S7)、170101(S8)、170401(S9)、170501(S10)。

2 特征图谱

2.1 色谱条件

采用资生堂CAPCELL PAK MG C18色谱柱(250 mm×4.6 mm,5 μm);以乙腈(A)-0.1%磷酸水(B)为流动相进行梯度洗脱,流动相梯度为:0~60 min,10%→20%A;60~84 min,20%→28% A;84~118 min,28%→48% A;流速:1.0 mL·min-1;柱温:30 ℃;检测波长:355 nm;进样量:20 μL。

2.2 溶液的制备

2.2.1 混合对照品溶液制备 取绿原酸、金丝桃苷、异槲皮苷、槲皮苷对照品适量,精密称定,加甲醇制成每1 mL含绿原酸0.36 mg、金丝桃苷0.03 mg、异槲皮苷0.02 mg、槲皮苷0.02 mg的混合对照品溶液,即得。

2.2.2 供试品溶液制备 取枇杷叶药材粗粉2 g,加入70%乙醇50 mL,称定质量,加热回流提取2 h,放冷,再称定质量,用70%乙醇补足减失的质量,摇匀,滤过,精密吸取续滤液25 mL蒸干,残渣加水10 mL使溶解;将其通过MCI GEL CHP 20柱(内径为1 cm,柱高为10 cm),以50 mL水洗脱,弃去水洗液,用50%乙醇50 mL洗脱,收集洗脱液,蒸干,残渣加80%甲醇适量使溶解,转移至2 mL量瓶中,定容至刻度,摇匀,0.45 μm微孔滤膜过滤即得供试品溶液。

2.3 方法学考察

2.3.1 精密度试验 取同一份2.2.2项下供试品溶液,按2.1项色谱条件,连续进样6次,记录各共有峰的保留时间和峰面积。以4号金丝桃苷峰为参照峰S,结果各共有峰相对保留时间的RSD在0.02%~0.17%,相对峰面积比值的RSD在0.2%~0.7%,均小于2.0%,表明该仪器的精密度良好。

2.3.2 稳定性试验 取2.2.2项下供试品溶液分别于制备后0、4、8、12、18、24 h,按2.1项色谱条件进样测定,记录各共有峰的保留时间和峰面积。结果各共有峰相对保留时间的RSD在0.01%~0.21%,相对峰面积比值的RSD在0.2%~0.9%,均小于2.0%,表明供试品溶液24 h内稳定性良好。

2.3.3 重复性试验 取同一批药材(批号170101)分别制备6份供试品溶液,按2.1项色谱条件进样测定,记录各共有峰的保留时间和峰面积。结果各共有峰相对保留时间的RSD在0.02%~0.22%,相对峰面积比值的RSD在0.9%~1.7%,均小于2.0%,表明该方法的重复性良好。

2.3.4 耐用性试验

2.3.4.1 不同色谱柱对测定的影响 分别取2.2.2项下供试品溶液,选用CAPCELL PAK MG C18(250 mm×4.6 mm,5 μm)、Ultimate XB-C18(250 mm×4.6 mm,5 μm)、Phenomenex Luna C18(250 mm×4.6 mm,5 μm)3根不同品牌的色谱柱,按2.1项色谱条件进样分析,均能达到枇杷叶药材特征图谱的测定要求。

2.3.4.2 不同仪器对测定的影响 实验选择安捷伦1260系列高效液相色谱仪、Waters e2695液相色谱仪和岛津LC-20A液相色谱仪,取2.2.2项下供试品溶液分别进样分析,结果3种仪器所得图谱均符合测定要求,表明不同仪器对供试品色谱峰的影响不大。

2.4 特征图谱的建立及共有峰的指认

2.4.1 特征图谱的建立 取10批及不同生长阶段的枇杷叶药材适量,分别按2.2.2项下方法制备供试品溶液,在2.1项色谱条件下进样分析,记录色谱图,采用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2012年版)》进行分析、比较,经多点校正和自动匹配后,生成对照特征图谱。共标定10个共有峰,选定这10个峰进行峰匹配,建立枇杷叶药材HPLC特佂图谱。

4号峰为对照品金丝桃苷,出峰时间适宜,峰形较好,故选择以金丝桃苷峰为参照峰S,其他9个色谱峰的相对保留时间分别为0.322 1、0.610 4、0.937 5、1.035 6、1.284 9、1.551 9、1.837 6、1.913 2和2.362 1,各共有峰相对保留时间的RSD在0.02%~0.39%,均小于2.0%,见图1。

注:R.对照图谱;S1~S10.批次。图1 不同批次枇杷叶药材的HPLC特征图谱

通过对不同生长阶段的枇杷叶药材的测定,结合《中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2012年版)》进行分析。以4号峰为参照峰,其他9个色谱峰的相对保留时间分别为0.322 9、0.610 7、0.938 2、1.034 8、1.282 7、1.551 4、1.836 7、1.912 3和2.359 6,其共有峰相对保留时间的RSD在0.13%~0.87%,均小于2.0%,见图2。

注:R.对照图谱;S1.干叶;S2.新叶;S3.成熟叶;S4.老叶;S5.落叶。图2 不同生长阶段枇杷叶药材的HPLC特征图谱

2.4.2 各共有峰的指认 取混合对照品溶液、枇杷叶药材适量,按2.2项下方法制备,在2.1项色谱条件下进样分析。结果表明,10批样品特征图谱的色谱峰均在118 min内全部出完,对所得特征图谱进行指认,选择稳定性、重复性好以及特征明显的色谱峰为共有峰,共标定了10个峰。其中1、4、5、6号峰分别为绿原酸、金丝桃苷、异槲皮苷和槲皮苷,见图3。

注:S1.空白溶液;S2.混合对照品;S3.供试品溶液;1.绿原酸;4.金丝桃苷;5.异槲皮苷;6.槲皮苷。图3 枇杷叶供试品、混合对照品及空白溶液HPLC图

3 含量测定方法与结果

3.1 溶液的制备

3.1.1 混合对照品溶液制备 取金丝桃苷、槲皮苷对照品适量,精密称定,加甲醇制成每1 mL含金丝桃苷0.034 2 mg、槲皮苷0.028 6 mg的混合对照品溶液,即得。

3.1.2 供试品溶液的制备 同2.2.2。

3.2 色谱条件

色谱条件同2.1,在此条件下,各待测组分与相邻峰之间的分离度均达到要求。空白溶液在与各待测组分相同保留时间处均未出现色谱峰(见图4)。

3.3 方法学考察

3.3.1 线性关系考察 精密吸取3.1.1项下的混合对照品溶液3、9、15、20、25 μL,注入液相色谱仪,按2.1项下色谱条件进行测定,记录峰面积。以峰面积(Y)为纵坐标,进样量(X)为横坐标,绘制标准曲线,求得回归方程为:金丝桃苷Y=69.528X-0.881 8(r=0.999 7);槲皮苷Y=57.908X-4.314(r=0.999 8)。结果表明,金丝桃苷和槲皮苷分别在0.102 6~0.855 0、0.085 8~0.715 0 μg呈良好的线性关系。

注:A.混合对照品;B.枇杷叶供试品;C.空白溶液;1.金丝桃苷;2.槲皮苷。图4 枇杷叶及对照品的HPLC图

3.3.2 精密度试验 取3.1.1项下对照品溶液,按2.1项下色谱条件连续进样6次,每次进样20 μL,记录峰面积。结果金丝桃苷和槲皮苷峰面积的RSD分别为1.40%、1.28%,表明该仪器精密度良好。

3.3.3 稳定性试验 取2.2.2项下供试品溶液,按2.1项下色谱条件分别在0、4、8、12、18、24 h进样20 μL,记录峰面积,结果金丝桃苷和槲皮苷峰面积的RSD分别为0.58%、1.08%,表明供试品溶液在24 h内稳定性良好。

3.3.4 重复性试验 按2.2.2项下供试品溶液制备方法平行处理同一批次(批号170101)样品6份,按2.1项下色谱条件分别测定,每次进样20 μL,记录峰面积。结果金丝桃苷和槲皮苷含量的RSD分别为2.16%、2.43%,表明该方法重复性良好。

3.3.5 加样回收率试验 取已知含量的同一批枇杷叶(批号170101)粗粉1.0 g,共6份,分别加入与样品中待测成分含有量相当的对照品溶液,按2.2.2项下方法制备供试品溶液,按2.1项下色谱条件进样20 μL,记录峰面积,计算平均加样回收率。金丝桃苷和槲皮苷平均加样回收率分别为99.76%、95.56%,RSD分别为4.88%、4.84%,结果表明该方法的回收率良好。

3.4 样品测定

取不同批次及不同生长阶段的枇杷叶药材适量,分别按2.2.2项下方法制备供试品溶液,在2.1项色谱条件下进行测定,平行测定3次,记录峰面积,测定结果见表1~2。

表1 不同批次样品测定结果 mg·g-1

表2 不同生长阶段的枇杷叶测定结果 mg·g-1

由表1~2发现,枇杷叶中两种黄酮类化合物的含量有一定的差异,说明其黄酮类成分因枇杷叶的生长环境、采集季节等而有所不同,其在不同生长阶段的分布规律有待进一步研究。

4 讨论

4.1 供试品处理方法的选择

样品在前处理过程中考察了加热回流提取、超声提取法及石油醚脱脂法[7-9],结果回流提取法使有效成分提取较完全,先后考察了乙醇的体积分数、用量、回流时间和回流次数的影响,结果方法确定为70%乙醇50 mL回流提取2 h。此外,还考察了柱色谱分离纯化法,比较了大孔吸附树脂D101型及MCI GEL CHP 20柱,因MCI GEL CHP 20柱洗去糖和其他水溶性成分,脱叶绿素效果好,且对皂苷类和黄酮类成分分离、纯化效果较好。

4.2 流动相系统的选择

为保证金丝桃苷和槲皮苷含量测定的准确性,减少误差,试验中分别考察了乙腈-水、乙腈-0.1%磷酸水溶液的流动相体系,结果表明,以乙腈-水为流动相进行梯度洗脱,基线波动较大,峰形不理想,而以乙腈-0.1%磷酸水溶液为流动相可以看出谱图中特征峰出峰时间适宜,且峰形较好,分离度好,基线漂移小,因此选择乙腈-0.1%磷酸水溶液为流动相系统。

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