杨晋，夏先明，贺凯，张孟瑜，冯春红，秦蜀

（西南医科大学附属医院 肝胆外科，四川 泸州 646000）

原发性肝癌是消化系统最常见的恶性肿瘤之一。我国由于乙肝人数多，患者治疗依从性差，全球每年约一半的新发肝癌病例发生在我国[1]。但目前关于肝癌发生、发展的机制尚不明确，因此，阐明肝癌发生、发展过程中的分子生物学机制或将有助于肝癌患者的早期诊断和治疗[2]。高迁移率族蛋白A2（high mobilitygroup protein A2,HMGA2）属于非组蛋白染色体蛋白，无转录活性[3]。其对基因转录的调节作用主要通过与染色质结合或直接与蛋白发生作用而实现[4]。 HMGA2 一般只在胎发育早期高表达，在正常成体组织中HMGA2 的表达水平极低或几乎检测不到[5]。 而在多种实体恶性肿瘤，例如胃癌、食管癌及结肠癌中HMGA2 呈高表达，这提示HMGA2 可能在恶性肿瘤的发生、发展过程中起重要作用[6]。目前关于HMGA2 与肝细胞癌关系的研究报道较少，因此本研究探讨HMGA2 表达与原发性肝细胞癌患者临床病理特征及其预后的关系，旨在为进一步阐明HMGA2 在肝细胞癌发生、发展中的作用提供 依据。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2010年1月—2013年1月在西南医科大学附属医院肝胆外科行手术切除的肝细胞癌患者 120例。其中，男性79例，女性41例；年龄32 ～83岁，中位年龄54 岁。临床分期以中晚期为主，Ⅰ、Ⅱ期55例，Ⅲ、Ⅳ期65例。纳入标准：①病理类型为肝细胞癌，且为首次确诊。②患者行手术治疗，手术切除标本保存于本院病理科，且标本符合本研究实验设计要求，即包括癌组织、癌旁组织及正常组织。排除标准：①围手术期非肿瘤性病因死亡。②同时合并有其他恶性肿瘤或有恶性肿瘤病史。③临床资料或随访信息不全。

1.2 试剂

鼠抗人HM GA2 单克隆抗体（美国Abcam 公司），免疫组织化学SP 试剂盒购（美国Zymed 公司）。一抗工作浓度为1 ∶100。二氨基联苯胺（Diaminobenzidine,DAB）显色试剂盒（武汉博士德生物工程有限 公司）。

1.3 方法

采用免疫组织化学染色，组织均经甲醛固定后，石蜡包埋，厚切片，厚度约4μm。对切片组织进行常规脱蜡、水化，过氧化氢去离子水孵育，阻断内源性过氧化物酶的干扰。乙二胺四乙酸液高温修复抗原，自然冷却后，磷酸盐缓冲液（phosphate buffered saline,PBS）冲洗，滴加100μl 鼠抗人HMGA2（浓度1 ∶100），4℃冰箱孵育过夜。PBS 冲洗3 次，2 min/次。滴加二抗，37℃环境下孵育20 ～30 min。PBS 冲洗 3 次，2 min/次。DAB 显色，苏木精复染，脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。以PBS 代替一抗作为阴性对照。采用半定量积分法判断阳性结果，以出现棕色颗粒作为HMGA2 阳性标准。染色强度评分：无染色0 分，浅黄色1 分，棕黄色2 分，棕褐色3 分；高倍镜（400 倍）下每张切片随机取10 个视野，每个视野计数100 个细胞，计算阳性细胞占同类细胞的百分数：细胞阳性率分为0 ～＜25%、25%～＜50%、50%～75%及＞ 75%，分别计为0、1、2、3 和4 分。两者乘积结果是0 分为阴性（-），1 ～4 分为弱阳性（+），5 ～8 分为阳性（++），9 ～12 分为强阳性（+++），将弱阳性和阳性定义为低表达，强阳性定义为高表达，将患者分为HMGA2 阳性组和HMGA2 阴性组，分别为59 和 61例。

1.4 统计学方法

数据分析采用SPSS 20.0 统计软件。计数资料以率（%）表示，比较用χ2检验，进一步的两两比较采用χ2分割法；绘制生存曲线，比较采用Log rank χ2检验；影响因素的分析采用Logistic 回归模型，P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 免疫组织化学染色

HMGA2 阳性表达呈棕黄色或棕褐色细颗粒状，主要定位于肿瘤细胞的细胞核。在120例患者中，HMGA2 在癌组织中的阳性率为35.8% （43/120），在癌旁组织中的阳性率为15.8%（19/120），在正常肝组织中的阳性率为8.3%（10/120），经χ2检验，差异有统计学意义（χ2=6.558，P= 0.000）。癌组织比正常肝组织和癌旁组织高。见 图1。

2.2 不同影响因素下肝细胞癌组织HMGA2 阳性表达率比较

图1 HMGA2 在肝细胞癌组织中的表达 （免疫组织化学×400）

不同临床分期、肝门淋巴结转移及肝内转移肝细胞癌患者的HMGA2 阳性表达率比较，经χ2检验，差异有统计学意义（P＜0.05）。HMGA2 阳性表达率在高临床分期、有肝门淋巴结转移及肝内转移肝细胞癌患者中较高。不同性别、年龄、肿瘤直径肝细胞癌患者的HMGA2 阳性表达率比较，经χ2检验，差异无统计学意义（P＞0.05）。见表1。

2.3 肝细胞癌组织HMGA2 阳性表达的多因素Logistic 分析

将临床分期、肝门淋巴结转移及肝内转移纳入Logistic 回归模型进行多因素分析，结果发现临床分期、肝门淋巴结转移及肝内转移均是影响HMGA2 阳性表达的独立危险因素（P＜0.05）。见表2。

2.4 两组患者3年生存率比较

HMGA2 阳性组患者3年死亡45例，生存率为23.7%，HMGA2 阴性组患者3年死亡33例，生存率为45.9%，经Log rank χ2检验，差异有统计学意义（χ2=6.481，P=0.011）。见图2。

表1 不同影响因素下肝癌组织HMGA2 蛋白阳性表达率比较

表2 肝细胞癌组织HMGA2 阳性表达的多因素Logistic 回归分析相关参数

图2 两组患者3年生存率比较

3 讨论

与其他恶性肿瘤一样，原发性肝细胞癌确切的病因及分子机制尚不完全清楚。其发病是一个阶段多、步骤多的复杂过程，受基因与环境双重因素影响，临床上以有肝区疼痛、腹胀及上腹部包块等症状为主[7]。 HMG 是由HMGA基因编码的一类非组蛋白家族，正常情况下，在高度分化或成熟细胞及组织中表达量极低，但在多种恶性肿瘤中，表达量则显著提高。 闫艳琴等[8]对60例食管鳞癌患者的病理标本进行检测后发现，HMGA2 在食管鳞癌组织及正常组织中的阳性率分别为71.0%和4.8%，差异有统计学意义。HELMKE 等[9]研究结果表明，HMGA2 在结肠癌中的阳性率为50%，在正常组织中几乎检测不到。而关于HMGA2 与肝细胞癌关系的研究则相对较少。刘蓓等[10]运用逆转录聚合酶链反应（reverse transcription polymerase chain reaction,RT-PCR）对103例肝癌患者的手术标本检测后发现，HMGA2 mRNA 在肝癌组织中的阳性表达率为43.69%，显著高于正常肝组织。本研究也发现，HMGA2 主要定位于肿瘤细胞的细胞核。与癌组织相比，正常肝组织和癌旁组织HMGA2 阳性率均较低。本研究中HMGA2 阳性表达率较文献报道[8-10]稍低，可能与本研究中患者的纳入标准、排除标准更为严格及本研究采用的免疫组织化学法敏感性稍低于RT-PCR 有关。

在免疫组织化学法基础上，进一步分析HMGA2表达与肝细胞癌患者临床病理特征的关系。HMGA2表达在高临床分期、有肝门淋巴结转移及肝内转移肝细胞癌患者中表达较高。进一步应用Logistic 回归模型进行多因素分析，结果发现临床分期、肝门淋巴结转移及肝内转移均是影响HMGA2 表达的独立危险因素，这表明HMGA2 表达对肝细胞癌患者淋巴结转移及肝内转移均有重要影响，这与刘颖等[11]和吕柏楠 等[3]的研究结果基本一致。笔者推测可能的原因为：①上皮钙黏蛋白基因的转录受生长因子β 信号通路中的SNAIL、TWIST等基因调控，HMGA2 可通过上调相关基因的表达抑制上皮钙黏蛋白基因转录，促进细胞间极性消失而诱发上皮细胞-间质转化（epithelial mesenchymal transition,EMT），而EMT 正是上皮细胞来源的恶性肿瘤细胞获得迁移和侵袭能力的重要生物学过程[12-13]。②HMGA2 表达与肿瘤血管生成密切相关。LI 等[13]报道称HMGA2基因表达与血管内皮细胞增殖、迁移存在明显的相关关系，高HMGA2 表达的肿瘤组织微血管更为丰富。上述因素共同作用，相互促进，使得HMGA2 阳性的肝癌细胞更易扩散，形成肝内外转移灶。

本研究提示临床分期、肝门淋巴结转移及肝内转移与HMGA2 阳性表达密切相关，这表明HMGA2 阳性患者出现转移的可能性更高，临床分期更晚，预后明显较差。因此，HMGA2 可作为判断肝细胞癌患者预后的一个潜在指标。

综上所述，HMGA2 定位于肿瘤细胞的细胞核，主要表达于癌组织，但在癌旁组织、正常肝组织中也有一定阳性率。临床分期、肝门淋巴结转移及肝内转移与HMGA2 表达密切相关。HMGA2 阳性患者预后明显较差，HMGA2 可作为判断肝细胞癌患者预后的一个潜在指标。