陈元椿 张创良 吴清权

(海南省干部疗养院 海南省老年病医院重症监护室，海南 海口 571100)

动脉粥样硬化(AS)是发生冠心病及出血性脑卒中的病理基础〔1,2〕。同时，随着我国人民生活水平的日益提高，高尿酸血症的患病率也在持续上升，特别是一些城市较发达的地区，高尿酸血症的检出高达5.0%～23.5%，已经接近发达国家水平〔3〕。血管内皮细胞损伤是AS等疾病发病的病理基础及早期环节〔4〕，有研究表明〔5〕，尿酸(UA)刺激人脐静脉内皮细胞后可以引起细胞炎症因子肿瘤坏死因子(TNF)-α、白细胞介素(IL)-6、单核细胞趋化蛋白(MCP)-1 及细胞黏附因子表达增加，因此炎症反应在高UA致心血管疾病中起到了重要作用，进而参与心血管疾病的发生、发展。自噬是一种普遍存在于真核细胞内的一个动态过程，主要用于维持并修复自身代谢。大量研究资料显示自噬能够参与AS的发生发展、炎症反应及代谢应激〔6〕，有研究报道〔7〕，自噬可以通过负调控炎性体，进而限制IL-1β 等炎症因子的表达。本研究旨在探讨自噬在高UA导致内皮细胞功能损伤中的作用。

1 材料与方法

1.1细胞株 人脐静脉内皮细胞(HUVEC)购于美国ATCC公司。

1.2试剂和仪器 RPMI 1640培养基(GIBCO公司)；小牛血清(FBS，GIBCO公司)；FITC标记羊抗鼠二抗(life公司)；UA，3-甲基腺嘌呤(MA)，丹酰戊二胺(MDC)，吖啶橙(AO)，微管相关蛋白1轻链(LC)3、自噬相关蛋白(beclin)1、β-actin单克隆抗体购自(Sigma公司)；细胞间黏附因子(ICAM)-1检测试剂盒、细胞内黏附因子(VCAM)-1检测试剂盒及IL-6检测试剂盒(CUSABIO公司)。荧光倒置显微镜 (IX53，OLYPUS公司)；二氧化碳培养箱(Thermo 公司)；生物超净工作台(life science公司)；电热恒温水槽(Yuan More公司)；凝胶成像系统，电泳仪(Tanon公司)；低温高速离心机(Thermo公司)；96孔板(costar公司)；酶标仪(Bio-Rad 公司)；CountessTM自动细胞计数仪(C10281，Invitrogen公司)。

1.3细胞培养和分组干预 将HUVEC细胞于37℃，5% CO2条件下，用含10% FBS的1640培养基培养，待细胞瓶内细胞生长回合度到达85%以上后，用含有乙二胺四乙酸(EDTA)的胰酶消化液消化细胞并进行传代，使用CountessTM自动细胞计数仪将HUVEC调整为1×106/ml后平铺6孔板，同时按实验分组，加入UA及自噬调控剂处理(UA终浓度为0.25 g/L，3-MA终浓度为10 μmol/L)，实验共分为3组，即对照组，UA组，UA+3-MA组(每组平行设立3个复孔)。

1.4HUVEC自噬染色 将对数生长期的HUVEC消化制成细胞悬液后，以每孔1×106细胞数接种于6孔板中,待细胞贴壁生长汇合达到85%后，将UA加入含HUVEC的培养基内，培养24 h后进行自噬检测，PBS洗3遍，弃上清，以4%的多聚甲醛，4℃下固定20 min，PBS洗2遍，分别加入终浓度为0.5 μg/ml的吖啶橙(AO)避光染色15 min后弃去染液及终浓度为 50 μg/L丹酰戊二胺(MDC)，37℃孵育 60 min，PBS洗2遍后用荧光显微镜观察结果。

1.5Western印迹检测自噬相关蛋白beclin1 和LC3I/Ⅱ的表达 将不同实验组HUVEC收集并提取总蛋白，蛋白定量后按3∶1的比例加入4×十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)上样缓冲液，用涡旋仪混匀后于100℃沸水中煮沸5 min，以30 μg蛋白每孔进行SDS-PAGE，转膜完成后用(TBST)洗涤液清洗3次，每次5 min，5% 脱脂奶粉的封闭液，37℃封闭2 h，用TBST洗涤3次，一抗4℃孵育过夜(LC3,beclin 1，β-actin单抗以1∶1 000倍稀释)，TBST洗膜3次，孵育含有辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗鼠免疫球蛋白(Ig)G 抗体(二抗体稀释度1∶5 000)，室温摇床振摇1 h，通过成像系统检测Western印迹结果。用Image Lab软件读取分析各蛋白条带的灰度值，以空白对照组为参照，计算实验处理组蛋白的相对表达量。

1.6酶联免疫吸附试验(ELISA)检测细胞黏附因子及IL-6和TNF-α表达 经UA及自噬抑制剂处理后，实验步骤参照试剂盒说明书，采用ELISA双抗体夹心法检测上清液中细胞间黏附因子(ICAM)-1，IL-6，TNF-α和细胞内黏附因子(VCAM)-1的变化，通过酶标仪检测样本的OD值，波长采用450 nm，并绘制标准曲线，将实验样本检测到的OD值带入标准曲线计算公式即可算出标本中的浓度。

1.7统计分析 采用SPSS17.0软件进行t检验。

2 结 果

2.1HUVEC培养及镜下观察 使用CountessTM自动细胞计数仪将HUVEC调整为1×106/ml，接种于6孔培养板内，倒置显微镜下观察发现，HUVEC呈贴壁生长，形态呈多边形鹅卵石形镶嵌排列，细胞轮廓清晰，折光性较好，生长约至48 h，细胞汇合度达到85%以上。见图1。

2.2HUVEC自噬染色 AO荧光染色在蓝光(502 nm)的激发下，酸性自噬体发橘红色荧光，碱性物质则为绿色荧光。MDC是自噬的特异性染料，荧光染色为亮绿色(355 nm)。通过自噬染色并对自噬泡进行计数得出结果(见图2、表1)，在培养24 h后，对照组HUVEC内自噬体数量较少，荧光强度较低；UA组的HUVEC染色后，自噬泡数量明显增加，荧光强度增强，与对照组相比明显升高(t=7.61、8.49，P<0.01)；UA+3-MA处理组自噬则被明显抑制。

图2 吖啶橙和丹酰戊二胺荧光染色检测HUVEC自噬的变化(×400)

组别AO染色MDC染色对照组2.04±0.073.24±0.11UA组12.36±1.951)14.28±2.131)UA+3-MA组6.45±1.528.12±1.17

与对照组比较：1)P<0.001；表3同

2.3Western印迹检测自噬相关蛋白beclin1 和LC3Ⅰ/Ⅱ的表达 经灰度值计算分析，与对照组相比，以浓度为0.25 μg/L的UA处理HUVEC 24 h后，自噬相关蛋白LC3Ⅱ/Ⅰ比值明显增加了4.64倍，beclin 1 表达量增加3.62倍，差异有统计学意义(t=10.52,P<0.01)，而加入自噬抑制剂3-MA后，LC3 Ⅱ和beclin 1蛋白表达明显下降，同时MCP-1表达也明显被抑制，见图3、表2。

图3 Western印迹检测HUVEC自噬蛋白LC3，beclin1蛋白的表达水平

2.4UA对ICAM-1，VCAM-1及IL-6和TNF-α表达影响 与对照组相比，高浓度的UA刺激HUVEC 24 h后，细胞炎症因子IL-6、TNF-α、ICAM-1、VCAM-1表达水平明显增加(t=62.58、18.44、25.75、46.15，均P<0.01)；在加入自噬抑制剂3-MA后，细胞炎症因子及黏附因子明显下降，与对照组相比差异无统计学意义(P>0.05)。见表3。

表2 Western印迹检测自噬相关蛋白beclin1 和LC3I/Ⅱ的表达水平

与对照组比较：1)P<0.05,2)P<0.001;与UA组比较：3)P<0.05

表3 ELISA法检测HUVEC细胞IL-6，TNF-α及ICAM-1，VCAM-1的表达水平

3 讨 论

流行病学调查结果显示〔8〕，高尿酸血症与高血压、冠心病、出血性脑损伤、代谢综合征、肾脏损伤等心血管疾病的发生发展有密切关系，高尿酸血症是血管内皮细胞损伤及炎症发生的重要危险因素〔9〕，目前已被公认是AS的主要发病机制之一，主要研究的机制包括：UA直接易从血液中析出并沉积于血管内皮上，造成损伤；参与炎症反应，刺激内皮细胞及单核细胞产生IL-1、IL-6、TNF-α等炎症因子；促进血小板黏附聚集于血管内壁。

研究表明，自噬及其相关信号通路在AS的发生发展中起到非常重要的作用〔10〕，通常血管内皮细胞在正常细胞自噬情况下，能够维持血管功能和形态，由于自噬过程中的溶酶体能够降解低密度脂蛋白(LDL)等，从而降低患者AS发生的概率及阻碍发展进程〔11,12〕。细胞自噬被阻滞或者过度激活都会改变血管内皮细胞的生物学功能，并且易引起纤维帽变薄，抑制胶原纤维的合成，从而导致AS斑块的不稳定。本研究结果提示UA可促进血管内皮细胞自噬。

AS发生发展的机制非常复杂，现有研究认为是由于细胞趋化因子、炎症因子及活性代谢产物等多重因素作用所导致，其中MCP-1因其对单核细胞具有很强的趋化活性，进而介导其黏附并迁徙入血管内膜下层。本实验研究结果提示自噬在调控UA诱导HUVEC分泌MCP-1蛋白中可起到重要作用。

近年来研究发现，炎症反应在冠心病、出血性脑卒中尤其是AS发展过程中发挥着重要的作用，现已经被公认是AS形成的早期重要标志〔13,14〕，多种炎症细胞和炎性介质在AS早期发挥着重要的作用，在加快AS的发展进程的同时，也在加快动脉粥样硬化斑块的去稳定性〔15〕。本研究结果提示自噬在UA诱导血管内皮细胞炎症因子和黏附因子表达中，起到重要的作用。从以上研究结果可以得出，自噬参与并调控血清UA诱导的血管内皮细胞损伤及炎症反应，细胞自噬可作为研究靶点，作为防治AS的方向之一。