倪宇昕 章立群 谢安琪 刘学 杨旭

(1华中科技大学协和深圳医院口腔科，广东 深圳 518000；2吉林大学口腔医院)

牙列缺损是老年人常见的口腔疾病，而种植治疗是最佳的治疗方案之一。口腔种植体周围炎是种植治疗最常见的并发症，病因是菌斑生物膜及其引起的免疫炎症反应。巨噬细胞是天然免疫系统的重要组成之一，能对外界刺激产生炎症反应〔1,2〕。有多个研究证明联合应用脂多糖(LPS)和干扰素(IFN)-γ刺激巨噬细胞后，会诱导M1型巨噬细胞极化，表现为白介素(IL)-1β、肿瘤坏死因子(TNF)-α和IL-6的升高，引起后续的炎症反应〔3～5〕。有学者报道了巨噬细胞的M1极化参与种植体周围炎的发生和进展〔6,7〕。

缬氨酸是人体必需的氨基酸之一，根据其构象可以分为L-缬氨酸和D-缬氨酸，在人体中存在的均为L-缬氨酸。前期研究显示L-缬氨酸参与众多的生理反应，影响炎症和肿瘤的发生与转归〔8,9〕。然而L-缬氨酸对巨噬细胞M1极化的作用还不清楚，本研究利用转录组测序的方法分析L-缬氨酸对巨噬细胞的作用。

1 材料和方法

1.1主要试剂和仪器 L-缬氨酸溶液0.384 mg L-缬氨酸(Sigma，美国)溶于10 ml磷酸盐缓冲液(PBS)中，制备成320 mmol/L的储备液，0.22 μm微孔滤膜过滤，4℃保存备用。LPS溶液：将购买的LPS(Sigma，美国)粉末用PBS稀释成500 μg/ml备用。IFN-γ溶液：将购买的重组小鼠IFN-γ(碧云天，中国)用PBS稀释成80 ng/μl备用。总RNA提取试剂盒购自上海生工公司(中国)，IL-1β、TNF-α和IL-6的酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒购自碧云天公司(中国)。使用的主要仪器有Invitrogen Qubit2.0光度计；Thermo台式高速低温离心机；北京六一DYY-11电泳仪；复日科技FR-980A生物电泳图像分析系统。

1.2巨噬细胞 小鼠巨噬细胞系Raw264.7细胞购自中国科学院细胞库，用RPMI1640完全培养液(含10%胎牛血清和1%双抗)，置于条件为37℃和5%CO2的孵箱中培养。

1.3实验方法 实验分为空白组、诱导组和L-缬氨酸组。空白组细胞使用RPMI1640培养液培养；LPS+IFN-γ组细胞应用条件培养液(RPMI1640完全培养液、50 μg/ml LPS、20 ng/ml IFN-γ)进行培养；L-缬氨酸组中细胞在条件培养液基础上分别增加0.8 mmol/L、0.4 mmol/L、0.2 mmol/L和0.1 mmol/L的L-缬氨酸。每组进行独立的3个生物学重复。

1.4ELISA检测 将上述各组细胞培养24 h后，分别收集培养基上清，经过10 000 r/min离心5 min后，将上清转移并进行ELISA检测。按IL-1β、TNF-α和IL-6试剂盒中说明，建立标准品对照，加入待测上清后进行洗板和显色等步骤，最后利用酶标仪读数，每组进行3次重复。

1.5转录组测序 向上述LPS+IFN-γ组和0.8 mmol/L的L-缬氨酸组细胞中，分别加入1 ml的Trizol溶液，按设计盒说明提取总RNA并应用Qubit2.0检测RNA浓度，琼脂糖凝胶检测RNA完整性及基因组污染情况。将质检合格的RNA交付上海生工公司进行建库与测序，所用测序平台为IlluminaHiseqTM 2000。获得下机数据后应用Fast QC软件进行质量评估和过滤，用Hisat2软件将质控后的reads同参考基因组进行对比。计算每个基因的(TPM)，并据此采用DESeq进行分析，将筛选条件设为：q值<0.05 且差异倍数log 2 FoldChange>1。最后根据筛选出的显著差异基因结果，将其注释到GO(Gene Ontology)和KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)数据库，并分析可能涉及的细胞活动。

2 结 果

2.1ELISA结果 当用LPS和IFN-γ联合刺激巨噬细胞时，检测的三种炎症因子均明显升高。当L-缬氨酸存在时，TNF-α表达量无明显规律性的变化；但是IL-1β与IL-6的表达出现明显剂量相关，即L-缬氨酸会促进这两种炎症因子的分泌。见表1。

表1 ELISA检测结果

与空白组相比：1)P<0.05

2.2RNA琼脂糖凝胶电泳 成功的提取了拟进行转录组测序的六个样品RNA，通过琼脂糖凝胶电泳结果表明RNA条带清晰，拖尾较少，完整度好，达到建库要求。见图1。

2.3差异基因表达 经过测序和质控，分别计算了不同样本的TPM值，并经过生物学重复，得到了L-缬氨酸组与空白组的显著差异基因28个，其中升高6个，降低22个，这些基因的TPM值及变化倍数如表2所示。

2.4GO和KEGG富集分析 将上述28个显著差异表达的基因分别进行注释，GO功能基因分类分析的结果如图2所示，三个大类中的多个亚类均有基因富集；KEGG分析结果如图3所示，三条通路的基因富集数尤为明显。

1：Marker，2～4：LPS+IFN-γ，5～7：0.8 mmol/L L-缬氨酸图1 琼脂糖凝胶电泳

表2 L-缬氨酸组中显著差异表达的基因信息

图2 显著表达差异基因的GO分析

图3 基于差异分析基因的KEGG分析

3 讨 论

种植体周围炎是口腔种植治疗最常见的并发症，表现为牙龈红肿、种植体松动甚至脱落，增加患者负担〔10〕。牙菌斑是种植体周围炎的始动因素，宿主的免疫反应也参与其中，影响种植体周围炎的进展与转归〔11，12〕。巨噬细胞是对牙菌斑刺激发生反应的最主要天然免疫细胞之一，其在感受到LPS存在后，会通过Toll样受体(TLR)引起下游NF-κB等信号通路的激活，最终引起诸多炎症因子的升高，包括TNF-α、IL-1β和IL-6等。这些炎症因子会通过级联反应，引发更为广泛和强烈的免疫反应，从而发挥清除细菌的作用〔13～15〕。但是过于强烈的炎症反应也会引起组织的破坏，促进种植体周围炎的发生。

通过ELISA结果可以发现，LPS与IFN-γ联合应用能够诱导巨噬细胞分泌炎性因子，这与前人研究〔16〕结果相符，随着培养体系中L-缬氨酸浓度的增加，巨噬细胞分泌的IL-1β和IL-6显著增加，但是对TNF-α的表达无明显影响，说明L-缬氨酸能够促进巨噬细胞的活化，从而发挥抗菌作用。IL-6发挥作用有两种途径，第一是cis途径，IL-6与细胞膜上的IL-6受体(IL6R)结合，引发gp130蛋白聚集形成三聚体；另一种trans途径，适用于细胞膜上没有受体的细胞，IL-6与可溶性的IL-6R(sIL6R)结合，引起下游gp130蛋白聚集。IL-6并不直接调控破骨细胞功能，而是通过trans途径影响RANKL表达，间接促进破骨细胞功能〔17，18〕。但是值得注意的是，高浓度的L-缬氨酸可能会过度诱发宿主的炎症反应，在实际应用中需要注意控制使用浓度，相关的最适浓度仍需进一步研究。转录组测序能够以高通量方式分析特定模式下的细胞mRNA表达情况，因此成为研究细胞作用和分析机制的高效方法〔19〕。GO注释分析，说明L-缬氨酸对于巨噬细胞的作用不止局限于炎性因子表达。随后的KEGG分析结果表明多个信号通路可能介导了L-缬氨酸的调控作用，例如PI3K-Akt通路、Rap1通路和Jak-STAT通路等。在其他研究〔20，21〕中，这些通路已被报道参与了巨噬细胞的激活过程。通过转录组测序研究，发现了多个潜在的作用途径，为进一步后续探讨L-缬氨酸调控巨噬细胞活化的机制提供了方向。本研究初步发现了L-缬氨酸能够促进巨噬细胞炎症因子的表达，并发现了可能的作用通路，但是考虑到L-缬氨酸在人体代谢中的基础地位，关于L-缬氨酸对巨噬细胞代谢中的作用和具体机制，仍然需要进一步研究。