徐子琴 王帅 陈冬

(1辉县市人民医院耳鼻喉科，河南 辉县 453600；2锦州医科大学附属第一医院耳鼻喉头颈外科)

变应性鼻炎(AR)是指个体暴露于过敏原后通过免疫球蛋白(Ig)E介导的介质释放、并有多种细胞因子等参与的引起鼻腔黏膜炎症的疾病，调查显示AR疾病影响了全球10%～40%的人口，老年性AR的患病率呈逐年上升趋势，目前以药物治疗控制临床症状为主〔1～3〕，然而其发病机制不详。随着人们对调节性T细胞(Treg)的研究，逐渐发现它是致敏阶段的关键细胞〔4〕。有学者研究发现，在AR小鼠模型及患者外周血中Treg细胞数目明显减少〔5,6〕，然而针对Treg细胞免疫失衡的调控因素尚无定论。T细胞免疫球蛋白和黏蛋白结构域(Tim)-3是Ig和Tim家族细胞表面分子，广泛参与肿瘤、哮喘及自身免疫性疾病等的免疫调节〔7〕，本研究主要探讨Tim-3是否通过调控Treg细胞的免疫失衡，进而参与AR的发病。

1 材料与方法

1.1标本收集 选取2017年7月至2018年10月就诊于锦州医科大学附属第一医院的患者和招募的志愿者作为研究对象。研究对象均为年满60周岁的老年人，均进行血清特异性IgE(sIgE)检测。第一部分实验：以招募的志愿者11例(男/女为4/7)为健康对照组，平均年龄(63.7±2.8)岁，以急性发作期入院的AR患者25例(男/女为9/16)为实验组，平均年龄(64.1±3.7)岁。第二部分实验：以急性发作期入院的AR患者30例，加入Tim-3的配体半乳糖凝集素(Galectin)-9激活前后进行对照比较。纳入患者符合AR诊断和治疗指南〔8〕的诊断标准依据。研究对象至少在1个月内没有发生过呼吸道感染疾病，都未曾服过全身糖皮质激素、抗组胺药、免疫抑制剂，除外结核、肝炎等传染性疾病和其他全身性疾病。本临床研究获得锦州医科大学附属第一医院伦理委员会的批准，且和每位招募的志愿者签订了知情同意书。各组受试者的性别、年龄等一般资料具有可比性。

1.2第一部分实验 两组均采集2 ml外周静脉血，提取外周血中的单个核细胞(PBMC)加入FC受体(FcR)阻断剂，均匀混合，避光孵育15 min后，加入APC/Cy7耦合的抗人CD4抗体、BV510耦合的抗人CD25抗体和PE耦合的抗人Tim-3抗体，避光孵育15 min后用磷酸盐缓冲液(PBS)清洗,1 200 r/min离心弃上清，加入固定液,常温避光45 min，然后加入破膜洗液，离心弃上清，再加入胞内Alexa647耦合的抗人叉头框(Fox)P3抗体，室温避光孵育1 h，最后加入对应破膜洗液，离心弃上清，用流式细胞仪检测Treg百分比及其细胞表面的Tim-3表达，用Flowjo10分析实验结果。

1.3第二部分实验 提取外周血中的PBMC加入淋巴细胞激活剂〔丙二醇甲醚醋酸酯(PMA)，离子霉素，高尔基体阻断剂〕、半乳凝集素(Galectin)-9，37℃孵育4 h后加入1 ml的PBS，离心弃上清，加入FcR阻断剂，室温避光孵育15 min后，加入Percp/Cy5.5耦合的抗人CD3抗体、异硫氰酸荧光素(FITC)耦合的抗人CD8抗体、BV510耦合的抗人CD25抗体，避光孵育15 min后用PBS清洗,1 200 r/min离心弃上清，加入固定液400 μl,常温避光45 min，然后加入破膜洗液，离心弃上清，再加入胞内Alexa647耦合的抗人FoxP3抗体和PE/Cy7耦合的抗人白细胞介素(IL)-10抗体,室温避光孵育1 h，最后加入对应破膜洗液，离心弃上清，用流式细胞仪检测Treg细胞分泌IL-10，用Flowjo10分析实验结果。

1.4统计学分析 采用SPSS22.0软件进行t检验、Fisher确切概率法、Maan-WhitneyU检验。

2 结 果

2.1两组外周血中Treg细胞及Tim-3+Treg细胞的表达 实验组Treg细胞百分比较对照组显著降低(P<0.01)，而实验组Treg细胞表面的Tim-3表达水平较健康对照组显著增高(P<0.01)。见表1、图1。

表1 两组外周血中Treg及Tim-3+Treg比较

1:外周血淋巴细胞群；2：CD4+细胞群；3：实验组Treg细胞；4：健康对照组Treg细胞；5：实验组Tim-3+Treg细胞百分比；6：健康对照组Tim-3+Treg细胞百分比图1 两组外周血中Treg所占比例及Tim-3+Treg细胞的比例

2.2相关性分析 AR患者中Treg的表达与其表面Tim-3的表达呈负相关(r=-0.785，P<0.05)。

2.3激活剂阻断前后外周血中Treg细胞比例及分泌IL-10+Treg的表达 阻断后外周血Treg细胞百分比较阻断前显著上调(P<0.01)。阻断IL-10+Treg较阻断前显著升高(P<0.001)。见表2、图2。

表2 Tim-3激活阻断剂前后两组外周血中Treg及IL-10+Treg的百分比

1:外周血淋巴细胞群；2：CD4+细胞群；3：阻断前Treg细胞百分比；4:阻断后Treg细胞的百分比；5：阻断前IL-10+Treg细胞百分比；6：阻断后IL-10+Treg细胞的百分比图2 激活剂阻断前后Treg百分比及IL-10+Treg的百分比

3 讨 论

AR是一种常见的过敏性疾病，主要是由IgE介导的，以释放炎症介质，并有多种细胞因子如肥大细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、T淋巴细胞等参与的鼻腔黏膜炎症的反应性疾病，主要临床症状是阵发性打喷嚏、流涕、鼻痒和鼻塞，严重者可伴发鼻息肉、鼻窦炎、哮喘及过敏性结膜炎等〔9〕。以前普遍以为AR主要由Th1/Th2细胞的免疫失衡反应所造成的，但随着人们对AR疾病的不断研究，该免疫失衡不足以解释AR的炎症反应。研究显示Treg数目的改变或功能的缺失在过敏性疾病的发病机制中发挥重要作用〔10，11〕。

Tim-3是Tim家族中的一员。既往研究指出，Tim-3主要通过调控Th1/Th2细胞的平衡从而参与Th2细胞介导的疾病，比如过敏性哮喘〔12〕。Banerjee等〔13,14〕发现Tim-3可以通过调节Treg细胞从而参与哮喘、炎症性疾病、自身免疫性疾病等的免疫调节,并在免疫自稳与凋亡细胞的清除过程中发挥重要作用，而Tim-3+FoxP3+Treg细胞的抑制功能要强于Tim-3-FoxP3+Treg细胞〔15〕。Galectin-9作为Tim-3的配体之一，与Tim-3结合后可以诱导T细胞的程序性死亡，被认为是Tim-3的激活剂〔16〕。有研究〔17〕表明Galectin-9可以通过抑制Th17细胞增强Foxp3+Treg从而改善自身免疫反应,但其作用依赖于与Tim-3的结合。本试验显示，体外给予激活剂Galectin-9后，患者血液中Treg细胞百分比及IL-10+Treg的百分比上调，提示了Galectin-9可以通过激活Tim-3通路抑制AR的炎症反应。

综上，Tim-3可能打破了Treg细胞在外周血中的平衡从而参与AR的发病过程；激活Galectin-9/Tim-3通路可以促使AR炎症转归。这可能为AR的治疗带来新的思路。