黄茉莉 梅晓冬 王卫阳

(1安徽医科大学附属省立医院呼吸科，安徽 合肥 230000；2安徽省胸科医院内一科)

慢性阻塞性肺疾病(COPD)可根据病情进展分为稳定期和急性加重期。稳定期的主要临床症状为不同程度呼吸困难，对患者肺功能及生活质量产生极大危害。其中炎性细胞分泌炎症因子参与了COPD复杂的发病过程，炎症反应使得气道和肺组织炎症反应增强，进一步导致肺功能进行性下降，出现呼吸衰竭甚至死亡。因此，为COPD患者提供有效的预防和治疗方案对及时掌握病情，采取诊治措施，减缓病情进展，提升其生活质量具有重要意义。本研究拟分析老年COPD患者血清中超敏C反应蛋白(hs-CRP)、肿瘤坏死因子(TNF)-α、血清白细胞介素(IL)-2、IL-4、IL-6、IL-8、IL-12等炎症因子水平与肺功能指标第1秒用力呼气容积(FEV1)/用力肺活量(FVC)与FEV1占预计值的百分比(FEV1/Pre)的关系。

1 对象与方法

1.1研究对象 连续入选2017年1月至2018年1月安徽省胸科医院COPD患者82例，根据COPD严重程度分级分为COPD Ⅰ级、Ⅱ级、Ⅲ级、Ⅳ级组；选择同时期在医院呼吸内科门诊检测的正常体检者为对照组41例，肺功能正常，且无呼吸道及恶性肿瘤等疾病。

纳入标准：诊断标准遵照《慢性阻塞性肺疾病诊治指南》(2013年修订)；年龄≥54岁，性别不限；近期无感染史、手术及外伤；近期无使用抗生素或免疫调节剂者；同意签署知情同意书。排除标准：患有严重心脏、脑部、肝肾疾病及恶性肿瘤者；长期使用糖皮质激素和病情严重需机械通气者；其他部位存在感染者；合并其他全身性慢性疾病者。COPD组与对照组一般资料差异无统计学意义(P>0.05)，见表1。

表1 各组基本资料比较

1.2仪器与试剂 hs-CRP测定试剂盒购自北京利德曼公司，人血清血浆α肿瘤坏死因子酶联免疫吸附试验(ELISA)检测试剂盒购自上海心语生物科技有限公司，IL-8、人IL-2、人IL-4、人IL-6、人IL-12 ELISA检测试剂盒购自美国R&D公司；肺功能机购自德国JAEGER公司，产品型号：MasterScreen。

1.3标本采集 使用肝素抗凝管抗凝采集两组晨起空腹状态时前臂外周静脉血5 ml，3 000 r/min高速离心15 min，离心后将血清小心转移至高压蒸汽灭菌的EP管中，-80℃保存备用。

1.4肺功能指标FEV1/FVC与FEV1/Pre的测定 肺功能采用德国JAEGER公司MasterScreen肺功能检测仪进行检测，参照肺功能检测操作指南，由专业技师严格按照仪器操作说明书指导患者进行检测操作。观察患者FEV1/Pre及FEV1/FVC。

1.5外周血TNF-α、IL-2、IL-4、IL-6、IL-8、IL-12含量的检测 利用ELISA检测血清中TNF-α、IL-2、IL-4、IL-6、IL-8、IL-12水平：将抗体用0.05 mol/L、pH9.6碳酸钠-碳酸氢钠溶液缓冲液稀释至蛋白浓度为5 μg/ml。在聚苯乙烯板的反应孔中加100 μl，4℃孵育过夜。次日弃去孔内试剂，用磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤3次，每次3 min。将待检血液样品用PBS按照1∶20稀释，取100 μl加入上述已包被好的反应孔中，37℃孵箱孵育1 h，取出后洗涤3次。于各反应孔中加入新鲜稀释的酶标抗体100 μl。37℃孵育1 h，洗涤5次。于各反应孔中加入临时配制的3,3',5,5'-四甲基联苯胺(TMB)底物溶液100 μl，37℃避光孵育15 min，每孔滴入1滴2 mol/L碳酸终止反应。在荧光检测仪上，以空白对照孔调零，于波长450 nm处测各孔OD值，若超过阴性对照OD值的2.1倍，视为阳性。

1.6血清hs-CRP水平的检测 利用免疫比浊法测定血清hs-CRP水平。严格按照CRP测定试剂盒说明书进行操作。可溶性免疫复合物在稀释体系中聚乙二醇的作用下，由液相析出形成微粒，导致反应液出现浊度。

1.7统计学处理 所有实验至少重复3次，采用SPSS18.0软件进行t检验、直线相关分析。

2 结 果

2.1各组FEV/Pre及FEV/FVC比较 与对照组比较，COPD组FEV/Pre及FEV/FVC均显著降低，且随着病情分级升高，降低越严重(P<0.05)，见表2。

2.2各组外周血hs-CRP TNF-α、IL-2、IL-4、IL-6、IL-8、IL-12水平 与对照组比较，COPD组hs-CRP、TNF-α、IL-6、IL-8指标均显著升高，且随着病情分级升高，各指标升高越明显(P<0.05)；而IL-2只有COPD Ⅲ、Ⅳ级组与对照组及Ⅰ、Ⅱ组有统计学差异(P<0.05)，COPD Ⅰ、Ⅱ组与对照组无显著差异(P>0.05)；而IL-4只有COPD Ⅳ级组与对照组及Ⅰ、Ⅱ组有统计学差异(P<0.05)，COPD Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组与对照组无显著差异(P>0.05)；COPD各组IL-12显著低于对照组，且随着病情分级升高，降低越明显(P<0.05)。见表3、表4。

表2 各组FEV1/Pre及FEV1/FVC比较

与对照组比较：1)P<0.05；与COPD Ⅰ级组比较：2)P<0.05；与COPDⅡ级组比较：3)P<0.01；与COPDⅢ级组比较：4)P<0.01

表3 各组外周血血清hs-CRP、TNF-α含量比较

与对照组比较：1)P<0.05；与COPD Ⅰ级组比较：2)P<0.05；与COPDⅡ级组比较：3)P<0.05；与COPD Ⅲ级组比较：4)P<0.05；表4同

表4 各组外周血血清IL-2、IL-4、IL-6、IL-8、IL-12含量比较

2.3患者FEV1/Pre及FEV1/FVC与血清hs-CRP、TNF-α、IL-2、IL-4、IL-6、IL-8、IL-12含量的相关性 COPD患者外周血中FEV1/FVC与hs-CRP、TNF-α、IL-6、IL-8呈负相关，与IL-12呈正相关(P<0.05)，FEV1/Pre与hs-CRP、TNF-α、IL-6、IL-8呈明显负相关，与IL-12呈正相关(P<0.05)，见表5。

3 讨 论

COPD是以不完全可逆并呈进行性发展的持续存在的呼吸气流受限为特征的慢性疾病，有害气体或颗粒刺激气道和肺导致慢性炎症反应性增加，伴随着气道清除功能减弱，患者肺部功能严重下降，对患者的劳动和生活质量造成严重影响〔1〕。中性粒细胞、T细胞、巨噬细胞等炎症细胞均参与了COPD炎症反应过程，分泌炎症因子并释放炎症介质，进一步破坏肺的结构和(或)促进炎症反应〔2,3〕。研究证实，炎症反应在COPD稳定期患者体内中也存在，且多发于全身多系统、多器官疾病，并不局限于肺部〔4〕。目前为止，COPD的主要治疗方式为对症治疗，但并不能很好控制疾病症状、改善生活质量。研究报道，COPD患者早期的预防和诊治是控制COPD疾病进程的关键〔5〕，因此发现更灵敏准确的诊断和预后指标成为了热点研究问题。

Hs-CRP是由肝细胞合成的急性时相蛋白，机体受到组织损伤或吸入有害气体等产生炎症刺激时会大量释放，且hs-CRP水平的上升不受放、化疗及糖皮质激素治疗的影响，可间接反映患者气流受限的程度〔6,7〕，本研究结果证实COPD患者体内hs-CRP与肺功能指标FEV1/FVC、FEV1/Pre均呈显著负相关，与之前的报道相一致〔5〕。

IL-2主要由T细胞分泌，具有活化T细胞、促进下游炎症因子产生与特异性免疫反应的作用〔8,9〕，IL-4、IL-6、IL-8等炎症因子的分泌均与IL-2的生物学功能有关〔10〕。IL-4主要由活化的Th2细胞分泌，研究证实IL-4与痰液在无纤毛的支气管上皮细胞积聚有密切关联，IL-4能诱导乳液腺蛋白合成增加，刺激支气管杯状细胞的黏液分泌，引起气道局部水肿〔11,12〕。IL-4还可以调控其他炎症因子的表达，产生炎症性抗体引起免疫应激反应〔13〕。有研究报道hs-CRP、IL-2和IL-4可协同发挥趋化和活化气道黏膜中炎症细胞的作用，产生局部炎症反应，参与COPD的发展过程。本研究结果提示，在COPD患者人群内血清IL-2与IL-4尚缺乏可以指示COPD患者肺功能的直接证据。

TNF-α是一种由单核-巨噬细胞产生的促炎因子，可诱导气道内皮细胞表达黏附分子，增加黏液分泌，引起组织纤维增生并诱导IL-6、IL-8等细胞因子；IL-6是多功能细胞因子，常见于hs-CRP等急性期蛋白质的合成，可以诱导浆细胞活化，引发全身广泛的特异性免疫反应，引起肺功能的降低；IL-8则对中性粒细胞具有明显的趋化与活化功能，加重机体内的炎症反应〔14,15〕。据报道，IL-6〔16〕、IL-8〔15〕及TNF-α〔17〕等炎症因子在COPD患者中亦呈现高表达状态，引起大量T淋巴细胞及中性粒细胞在黏膜内聚集，参与免疫反应及气道炎症，对小气道和肺泡组织结构和功能造成损伤〔12,18〕。本研究结果表明炎症因子TNF-α、IL-6、IL-8水平可作为判断COPD患者肺功能的指标。

IL-12是活化自然杀伤(NK)细胞和T细胞分泌的Th1型细胞因子，可以诱导NK细胞和T细胞分泌干扰素(IFN)-γ〔12〕，可介导机体固有免疫与适应性免疫〔19,20〕。研究显示，急慢炎症可下凋巨噬细胞分泌的IL-12，从而促进炎症的发展〔21,22〕。本研究结果显示COPD患者外周血IL-12水平显著低于对照组，且随着COPD分级增高，IL-12下降越明显，与肺功能指标呈正相关，与之前的研究相一致〔5〕。

综上，hs-CRP、TNF-α、IL-6、IL-8、IL-12与COPD患者肺功能指标存在显著相关，可作为判断COPD病情严重程度和预后的指标。