陈丹丹 朱肖鸿

浙江中医药大学附属第一医院 浙江 杭州 310006

肝纤维化（HF）是指由于各种致病因子致肝内结缔组织异常增生，肝内细胞外基质广泛过度沉积的一种病理过程，是所有慢性肝病的病理基础[1]。肝纤维化是慢性肝病的重要病理特征，是疾病发展成为肝硬化的一个必经阶段[2]。T淋巴细胞是介导细胞免疫应答的主要免疫细胞，细胞免疫对于保持机体的正常免疫监视、防御和调节功能，避免机体发生合并感染、恶性肿瘤、自身免疫性疾病发生有重要作用，CD4+T淋巴细胞、CD8+T淋巴细胞是具有不同功能的T淋巴细胞亚型，前者主要起辅助T细胞作用，后者具有杀伤T细胞效应。肝硬化患者多存在免疫功能紊乱或免疫功能低下，当T淋巴细胞亚群比例失调时，肝硬化患者容易发生严重的合并感染或向恶性肿瘤转变[3]。本实验主要研究熊胆粉治疗前后肝纤维化大鼠CD4+T淋巴细胞、CD8+T淋巴细胞的变化。

1 实验材料和仪器

1.1 实验材料：10g雄性SPF级F344大鼠27只，购自南方模式动物中心[生产许可证：SCXK（苏）2015-0001，使用许可证：SYXK（苏）2015-0001]。PBS：生产厂家Solarbio，中国北京。CD4-FITC：生产厂家ebioscience，11-0040-82。CD8-PE：生产厂家ebioscience，12-0084-80。Ficoll：生产厂家GE，17-5442-02。

1.2 实验仪器：CO2细胞培养箱：生产厂家Thermo Scientific，Waltham，USA。倒置显微镜：生产厂家Olympus，Tokyo，Japan。生物安全柜：生产厂家Thermo Scientific，Waltham，USA。常温/冷冻离心机：生产厂家Eppendorf，Hamburg，German。移液器：生产厂家Eppendorf，Hamburg，German。流式细胞仪：生产厂家 Novocyte，451140510506。

2 实验方法

2.1 实验分组及处理方法：对照组9只：注射用生理盐水1ml/kg连续每周3d，腹腔内注射共4周，同时用生理盐水2ml/d灌胃，共4周；肝纤维化模型组（模型组）9只：10g/L二甲基亚硝胺（DMN）（生理盐水稀释）1ml/kg连续每周3d，腹腔内注射共4周，同时用生理盐水2ml/d灌胃共4周；熊胆粉治疗组（治疗组）9只：10g/L DMN腹腔内注射的同时用熊胆粉400mg/kg•d灌胃共4周。在第2周末和第4周末，进行细胞检测。

2.2 流式细胞检测：流式细胞术检测CD4+、CD8+T淋巴细胞比例及CD4+/CD8+的比值。

2.3 统计学分析：组间分析采用Student’s t test（两组）或单因素方差分析（one-way ANOVA，两组以上）方法。结果用平均值±标准误差（Mean±SD）表示。P＜0.05视为具有显著差异。

3 实验结果

与对照组相比，肝纤维化模型组肝组织来源的细胞群中CD4+阳性细胞的比例显著降低（P＜0.05），CD8+阳性细胞的比例显著升高（P＜0.01），CD4+/CD8+比值显著降低（P＜0.01）；熊胆粉治疗组肝组织来源的细胞群中CD4+阳性细胞的比例降低（P＜0.05），但显著高于肝纤维化模型组（P＜0.01），CD8+阳性细胞的比例显著升高（P＜0.01），但显著低于肝纤维化模型组（P＜0.01），CD4+/CD8+比值显著降低（P＜0.01），但显著高于肝纤维化模型组（P＜0.01）。上述结果表明肝纤维化大鼠肝细胞中CD4+阳性细胞比例及CD4+/CD8+比值较正常组显著降低，CD8+阳性细胞比例显著升高，而熊胆粉对肝纤维化大鼠肝细胞中CD4+阳性细胞降低、CD8+阳性细胞比例的升高及CD4+/CD8+比值降低有显著的负调控作用。见表1和图1。

表1 各组CD4+、CD8+及CD4+/CD8+比较（±s）

表1 各组CD4+、CD8+及CD4+/CD8+比较（±s）

注：与对照组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与模型组比较，##P＜0.01。

CD4+/CD8+2.97±0.28 0.48±0.06**0.78±0.06**##组别 只数对照组 9模型组 9治疗组 9 CD4+（%）50.54±4.13 31.91±0.61*38.32±1.13*##CD8+（%）17.03±0.23 66.89±6.61**49.38±4.13**##

图1 流式检测CD4+和CD8+阳性细胞的比例

4 讨论

肝硬化是多种慢性肝脏疾病的终末阶段，以弥漫性肝纤维化伴异常结节形成为其形态学特征，严重影响人类健康。目前尚无有效的抗肝纤维的化学或生物药物进入临床应用[4]。近年来，多有报道显示中医药在抑制肝脏炎症反应、调节免疫功能及纤维组织增生，促进肝纤维化的逆转等方面效果明显[5-6]。浙江已故名中医潘澄濂擅长治疗肝病，将肝硬化分为积聚型和鼓胀型辨治，并总结病毒性肝炎后肝硬化的八种治法[7]，颇有疗效。

熊胆为熊科动物黑熊或棕熊的干燥胆囊，是临床常用的传统名贵药材。其味苦，性寒，归肝、胆、心、胃经，具有清热解毒、平肝明目、杀虫止血之功[8]。现代药理学研究[9-10]发现，熊胆粉水解液中，含有去氧胆酸、熊去氧胆酸、鹅去氧胆酸[11]。权明吉等[12]用DMN诱发大鼠肝纤维化，予400mg/kg熊胆粉灌胃4周，结果发现熊胆粉可以抑制DMN诱发大鼠肝纤维化。研究现已证实[12]，熊胆可通过抑制肝星状细胞激活与转化而减轻DNM所致肝损害，抑制肝纤维化形成，进而减缓肝硬化进程。

T淋巴细胞是一类重要的免疫细胞，T细胞的比值和绝对数发生改变被认为是免疫功能紊乱。成熟的T细胞根据CD4+、CD8+分子表达的不同，可以分为CD4+或CD8+T细胞。CD4+T细胞因为具有辅助体液免疫和细胞免疫的功能，所以被称为辅助性T细胞。有研究表明，肝硬化患者存在免疫功能下降。本研究发现，通过DMN诱发大鼠肝纤维化，从免疫方向研究得出，肝纤维化大鼠肝细胞中CD4+阳性细胞比例及CD4+/CD8+比值较正常组显著降低，CD8+阳性细胞比例显著升高。结果显示，熊胆粉对肝纤维化大鼠肝细胞中CD4+阳性细胞降低、CD8+阳性细胞比例升高及CD4+/CD8+比值降低有显著的负调控作用。