王振宇 钱 祥 张爱琴

1 浙江省杭州市丁桥医院 浙江 杭州 310021

2 浙江省肿瘤医院 浙江 杭州 310022

“肺与大肠相表里”是中医学的经典理论，笔者基于此，通过实验研究清肺合剂对肺癌小鼠疗效及肠道菌群多样性。报道如下。

1 材料与方法

1.1 动物与药品：C57BL/6小鼠，由上海斯莱克实验动物有限责任公司提供，动物生产许可证号：SCXK（沪）2017-0005。饲养条件：恒温，温度22±2℃，湿度50%～60%，光照每12小时明暗交替，换风次数15～20次/小时。实验饲养室许可证号SYXK（浙）2018-0012。清肺合剂（浙贝母、防己各41.1g，白花蛇舌草、龙葵、半枝莲、白茅根各109.6g，重楼35.6g，仙鹤草、夏枯草各54.8g，天龙3条。浙江省肿瘤医院采购）。

1.2 建模与分组：小鼠LEWIS肺癌细胞置于含10%胎牛血清及高糖DMEM的完全培养基中，置于37℃、5%CO2培养箱中培养，1～2天更换培养液1次，每3天用0.25%胰酶传代1次。细胞汇合率达90%时收集细胞，离心去上清液加PBS吹打使细胞悬浮于PBS中，台盼蓝染色细胞活力测定大于95%，并进行细胞计数，调整细胞浓度为4×107/ml的细胞悬液备用，每只小鼠尾静脉注射0.2ml细胞量。将小鼠尾巴上毛剃干净，将混有Matrigel的细胞悬液用2ml针管在室温下放置2min后注射入尾静脉，获得肺癌小鼠组模型。将共计48只小鼠（肺癌小鼠32只，常态小鼠16只）分为对照组（常态小鼠）、模型组及清肺合剂组各16只。A：对照组：0.5%羧甲基纤维素钠（CMC）灌胃；B：模型组：0.5%羧甲基纤维素钠（CMC）灌胃；C：清肺合剂组：0.5%羧甲基纤维素钠+清肺合剂灌胃。

1.3 测量及活体成像：肿瘤体积用游标卡尺测量长径和短径，以长径×短径×短径/2的计算方法计算体积。

1.4 粪便DNA提取与16S rRNA PCR扩增及Illumina测序：采集的小鼠粪便按TIANamp Stool DNA kit试剂盒说明进行。用紫外分光光度计检测DNA浓度及纯度，1%琼脂糖凝胶电泳跑胶观察DNA完整性。质检后选取合适DNA样本进行后续分析。

1.5 数据分析：采用SPSS 16.0统计软件进行数据分析，所有数据以均值±标准差表示，P＜0.05为差异有统计学意义。多组计量资料采用单因素方差分析（One-Way ANOVE），组间两两比较方差齐性者采用T检验，方差不齐者采用Dun-nett’T3检验。用活体成像仪在实验结束前，对小鼠肿瘤状态进行观察。通过生物数据分析进行OTU聚类及注释、Alpha多样性、Beta多样性、群落组成分析、组间差异分析等。

2 结果

2.1 瘤体大小分析及活体成像：模型组肿瘤体积2416.12±396.83mm³，清肺合剂组肿瘤体积为2003.48±280.50mm³。清肺合剂组瘤径均有一定程度减小，差异具有显著性（P＜0.05）。说明清肺合剂对肺癌疗效明确。

2.2 肠道菌群多样性分析：分述如下。

2.2.1 OTU聚类及venn图：OTU聚类：首先将序列完全一样的Clean Reads根据其丰度大小进行排序，将其中的Singletons过滤掉，利用Usearch在0.97相似度下进行聚类，对聚类后的序列进行嵌合体过滤后，得到用于物种分类的OTU，最后将所有Clean Reads比对到OTU序列上，将能比对上OTU的Reads提取出来，得到最终的Mapped Reads。统计各个样品每个OTU中的丰度信息，OTU的丰度初步说明了样品的物种丰富程度。通过上述方法进行OTU的聚类，3组小鼠共产生了601个OTU。如图1所示，图中可以看出3组之间相似的OTU占了大部分，3组共有的OTU为390个。不同组间也存在一些其特有的OTU，实验要寻找的肺癌关键菌以及清肺合剂作用靶向菌，很可能就在其中。

图1 OTU venn图

2.2.2 OTU PCA分析：PCA可以初步反映出不同处理或不同环境间的样品可能表现出分散和聚集的分布情况，从而可以判断相同条件的样品组成是否具有相似性。由以下PCA分析可以看出清肺合剂组肠道菌群的组成成分与正常小鼠组更具有相似性，而肺癌组则相对来说差异较大，在一定程度上说明了清肺合剂的疗效，小鼠活体成像的结果一致，见图2。

图2 PCA分析

2.2.3 物种丰度分析：根据物种注释结果，对各个样品做属水平物种profiling相应的柱状图，形成物种相对丰度柱状图。为了更加直观地体现各组间差异，根据样本分组信息，把各组内数据叠加，作出三组小鼠的物种profiling柱状图。然后为了进行展示，绘制了PCA图。从图3可以看出，清肺合剂组的肠道菌群构成更接近正常小鼠组，与肺癌模型组具有显著差异性，反映出清肺合剂对于肺癌小鼠肠道菌群结构产生了影响，使之更接近正常小鼠的肠道菌群结构。

图3 属水平差异显著物种的PCA结果展示

表1 肠道菌群组间差异性分析

我们通过组间差异分析，进一步寻找清肺合剂起效的关键菌。使用秩和检验的方法对不同分组之间进行显著性差异分析，以找出对组间划分产生显著性差异影响的物种。差异分析采用R语言stats包的kruskal.test函数。通过Kruskal-Wallis test分析可以找出在不同组间有明显差异(P＜0.05)的属（共5个）。见表1。

3 讨论

中医学“肺与大肠相表里”阐述了肺与大肠的密切联系，在西医学上肺与大肠在生理及病理上也密切相关。肺部疾病能够影响肠道菌群的种类及分布，反之肠道菌群的种类及分布也能够影响肺部疾病的发生与发展。近年来随着肠道菌群研究热潮的兴起，肠-肺轴（Gut-lung axis）的面纱也在一层层地被人们所揭开。清肺合剂从中医学“肺积”切入，可以上溯到《景岳全书》，经过我院几代中医工作者的多年实践研究调整，功效清热解毒、软坚散结、活血化瘀，主要治疗肺癌、放射性肺炎、咳嗽多痰、胸痛、咯血等。清肺合剂与化疗、放疗联用，术后及姑息性使用，都被证实对肺癌有积极疗效。清肺合剂中浙贝母、白花蛇舌草味苦性寒合而为君药。龙葵味苦微甘性寒，清热解毒、化痰止咳；重楼味苦性寒，清热解毒；半枝莲味苦性凉，清热解毒；白茅根凉血止血；仙鹤草收敛止血；夏枯草散结消肿合而为臣药。防己利水消肿；天龙活血散结解毒合而为佐药。其余为使药。

Gevers D等[1]发现炎症性肠病（IBD），克罗恩病（CD）患者肠道中Erysipelotrichaceae含量明显低于正常值。Chen W等[2]发现低水平的Erysipelotrichaceae与结直肠癌密切相关，是其核心菌群。正常小鼠中Erysipelotrichaceae水平明显高于其余两组，肺癌可能能够影响Erysipelotrichaceae的含量，使其显著下降，从而致病。Dziarski R等[3]发现高水平的Alistipes与肠道炎症的发生发展密切相关。而Fenner L等[4]发现Alistipes还与结肠癌有明显联系。笔者前期实验也证明了Alistipes是肺癌患者与正常患者肠道菌群差异的关键致病菌。肺癌小鼠中Alistipes水平明显高于其余两组，肺癌可能能够影响Alistipes，使其含量显著增加。而清肺合剂干预组中该菌较肺癌组明显减少，可能与清肺合剂的干预有关。Ottman N等[5]发现在清肺合剂干预组中明显增多的Akkermansia具有改善代谢反应、调节宿主的免疫反应和恢复肠道屏障功能[6]。清肺合剂干预组提高了小鼠肠道中的Akkermansia，改善代谢反应，调节宿主的免疫反应和恢复肠道屏障功能，从而阻止了肠道中有毒有害物质进入肺部，并且降低了肺癌关键菌Alistipes的水平，抑制了肠道炎症水平。而PCA图也体现出了清肺合剂干预组的肠道菌群分布更贴近常态小鼠组，侧面反应出了清肺合剂对肺癌的作用。

通过查阅文献资料，其余两菌暂未发现与肠道疾病及肺部疾病发生发展相关的特异性。Erysipelotrichaceae、Alistipes可能就是我们要找的肺癌小鼠在肠道中的关键菌群，肺癌能够降低Erysipelotrichaceae的丰度，提高Alistipes的丰度，从而影响着肿瘤的发生与发展；而Akkermansia、Alistipes是清肺合剂在肠道中的靶向菌群，清肺合剂可以降低Alistipes的丰度以及提高Akkermansia的丰度，起到提高机体免疫力及抑制肿瘤生长的作用。

实验结果可以看出，肺癌的发生和发展与肠道菌群有着密切联系，而清肺合剂对于肺癌的治疗也有着肠道菌群的参与。本次结果是祖国医学在“肺与大肠相表里”理论正确性上的一个表现。肠道菌群作为肠道的一个重要组成部分，与肺部的主要病理疾病肺癌被证明存在着非常密切的关系。中医学从表里经入手，通过归经为大肠的药物，对肺癌起到疗效。那么能否以肠道菌群作为靶点，能否通过改善Erysipelotrichaceae、Alistipes丰度分布，从而影响肺癌发生发展，对肺癌起到积极的治疗效果，成为肺癌防治的新靶点，从而为肺癌的防治提供了一个新的思路，新靶点和新的技术平台，还有待实验的论证。