刘海燕，任青兮，马莺

(1.哈尔滨工业大学，哈尔滨150001；2.新控国际健康管理有限公司，成都610041)

0 引 言

牛乳是一种复杂的胶体多级分散体系，其物理和化学性质取决于内在因素如组成和结构，外在因素如温度和挤奶后处理。热处理是乳品加工过程中的重要环节，热杀菌的同时还赋予了商品乳特殊的风味和理化特性。液态乳根据热处理方式分为巴氏杀菌乳和UHT乳[1-2]。牛乳作为一种热敏性物料，热处理会对其营养成分和乳液的热稳定性产生显著影响[3]。本实验以两个工厂巴氏乳和UHT乳为研究对象，以原料乳做对照，系统的研究了热处理前后化学性质（成分组成和pH、游离氨基酸、维生素C和泛酸以及钙离子的释放）和物理性质（粒径、黏度和感官特性）的变化，综合这些指标分析，以期为乳品企业液态乳的加工以及为消费者选择牛乳产品提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

材料：分别来自两个乳品厂（F1和F2）生产的巴氏乳和UHT乳，以同批次原料乳为对照。

试剂：磷酸二氢钾、磷酸一氢钾、甲醇、盐酸、硫酸锌、过氧化氢和四甲基氢氧化铵等。

1.2 仪器与设备

傅立叶红外全谱扫描乳品成分快速分析仪（MilkoScan FT 120，FOSS丹麦），氨基酸分析仪（121MB，Beckman，美国），液相色谱仪（LC-10AD,Shimadzu日本），钙离子选择性电极（9720BNWP，Thermo Scientific美国），电感耦合等离子体质谱分析（7500a，Agilent美国），离心机（3-30k，Sigma美国），纳米生物颗粒分析仪(qNano，Izon Science Ltd新西兰)，流变仪（Kinexuspro+，Malvern英国）。

1.3 实验方法

1.3.1 基本成分测定

取8 mL乳样品采用乳品成分快速分析仪测定乳中基本成分：脂肪、蛋白质、乳糖、非脂固形物和总固形物，实验结果以百分含量表示。

1.3.2 游离氨基酸的分析

乳样品经过前处理后，参考张勇[4]等人的方法进行游离氨基酸的分析。具体如下，采用氨基酸专用分析柱(180×2.8和80×2.8)，以pH为3.28、3.90和 5.26的柠檬酸缓冲液作为流动相进行梯度洗脱，分析参数如下：进样量50μL，流速10 mL/h，柱温54℃。检测器波长:脯氨酸在440 nm下检测，其他氨基酸均在570 nm下检测,采用柱后衍生,茚三酮流速5 mL/h。

1.3.3 维生素C和泛酸的测定

维生素C使用液相色谱分析。条件如下，色谱柱：AQ-C18柱（4.6×250 mm,5μm）；流动相：0.05 mol/L磷酸二氢钾：甲醇（96∶4）；流速：1.0 mL/min；检测波长：285 nm；柱温：30±1℃。进样量：20μL。按维生素C的色谱峰计算，理论塔板数≥3 000，维生素C的分离度大于10，采用外标法定量。

泛酸的测定参考GB 5413.17-2010。条件如下，色谱柱：ODS-C18（5μm，250 mm×4.6 mm）；流动相：0.05 mol/L磷酸二氢钾/甲醇（9:1）；流速：1.0 mL/min；检测波长：200 nm；柱温：30±1℃；进样量：10μL。采用外标法定量。

1.3.4 钙的释放和利用率的测定

使用钙离子选择性电极测量游离钙。每25 mL样品或标准品加入0.5 mL ISA（离子强度调节剂），所有测量均在30℃水浴中进行。在测量之间用蒸馏水冲洗电极。

使用电感耦合等离子体质谱（ICP-MS）分析乳中的总钙[5]。仪器参数如下：射频功率1550 W；载气流速1.03 L/min；采样深度8 mm；采用同心雾化器，雾化室温度为2℃。

1.3.5 粒径

采用qNano仪器分析乳的粒径。1 mL牛乳，2 000 g离心10 min，用100%PBS稀释10倍，经0.45μm微膜过滤，再用100%PBS进一步稀释1 000倍，采用NP200纳米滤芯测量酪蛋白胶束颗粒；牛奶采用100%PBS稀释10倍，经过5μm微膜过滤，使用100%PBS进一步稀释1 000倍，采用NP800纳米滤芯测量均质后较小的脂肪颗粒；牛乳样品使用10%PBS稀释10倍，用10%PBS进一步稀释500倍，用NP4 000纳米滤芯测量原料乳中未均质的较大的脂肪颗粒。

1.3.6 黏度

Malvern旋转流变仪被用于黏度分析，转子型号：cp/25。向样品槽中加入18.0 mL的待测乳样品。测试条件：恒温25℃，剪切速率为10 s-1和50 s-1，测试时间为10 min，保存测定结果并分析。

1.3.7 感官评价

采用风味描述分析（Flavor Profile Analysis）进行感官评价。经过系统的筛选和培训，选取10名具有丰富经验的评价员，其中1人担任负责人。

制定描述词汇表。每位评价员将感知到的风味特征（香气、风味、口感和余味等）分别记录，然后汇总描述词，并小组讨论改进，形成一份带有定义的描述词汇表。最终确定了16个描述词汇如下：

香气：巴氏奶味，黄油味，奶油味，蒸煮味，哈败味；

味道：甜味，咸味，奶腥味，塑料/化学味，椰子味，饲料味，苦味；

口感：厚实，油腻感，粉感，涩感。

评价员参照描述词汇表按照感知的风味特征顺序写下相应描述词，并给出风味特征的强度评价。强度标度为0～5分：0没有；1若有若无；2有一点；3明显；4较强；5极强。

1.3.8 统计分析

所有分析均重复3次，最后结果以均值±标准方差（mean±sd）表示。采用SPSS（版本23.0，SPSSInc.，美国）对数据进行方差分析（ANOVA）和最小显著性差异检验（LSD），以P＜0.05具有统计学意义。

2 结果与分析

2.1 热处理对牛乳化学性质的影响

2.1.1 热处理对乳成分和pH的影响

热处理是减少腐败菌和消除潜在致病微生物的重要手段。然而，随着受热强度增加而依次发生的蛋白变性、乳糖异构化以及美拉德反应等也会对牛乳的成分和pH产生影响[6]。以原料乳为对照，测定了两个工厂巴氏乳和UHT乳的成分（见表1）。与原料乳相比，巴氏乳和UHT乳中的脂肪、蛋白质、乳糖、总固形物和非脂固形物的含量存在一些统计学差异，但是它们在乳中的总含量并没有呈现规律的变化，工厂F1和F2巴氏乳和UHT乳中脂肪含量为3.79%～3.92%，蛋白质为3.06%～3.18%，乳糖为4.26%～4.38%，总固形物为11.89%～12.25%，非脂固形物为8.46%～8.65%。乳的pH变化基本在0.1个单位左右，因为牛乳中以钙离子为代表的胶体磷酸钙、磷酸钙和游离钙离子矿物盐动态平衡维持了体系的pH平衡[1]。牛乳在经过热处理之后，牛乳中脂肪、乳糖、固形物等主要营养成分的组成和结构会发生变化，但总量并无显著损失。例如，乳清蛋白加热会变性，但本身并不会对其营养价值产生不良影响，相反，热处理后变性的蛋白结构更松散，其更容易被蛋白酶水解，更易被人体消化吸收[7-9]。

2.1.2 热处理对乳中游离氨基酸的影响

牛乳从乳腺分泌时本身含有大量游离氨基酸（FFA），它在乳中占总氮的2%，是重要的现成氮来源[10-11]。热处理以及微生物蛋白酶还会使一部分蛋白水解成氨基酸，因此，乳中游离氨基酸的组成和含量能够在一定程度上反映蛋白质结构和营养价值的变化[4,7]。原料乳、巴氏乳和UHT乳中游离氨基酸的组成和含量见表2。6个乳样品中均检测出17种游离氨基酸，其中HIS含量最高，占氨基酸总量的58%以上，MET含量最低（＜0.4 mg/100 g）。相较于原料乳，工厂F1巴氏乳和UHT乳中的ASP、GLU、ILE和LEU的含量显著降低，这可能是因为这四种氨基酸更容易与乳糖共热发生美拉德反应[2,9]。F1的三种乳中GLU的含量差异不显著，这可能跟其结构更稳定有关[4]。而THR在F1工厂UHT乳中的含量显著高于原料乳和巴氏乳，这是因为牛乳经过巴氏和UHT不同强度的热处理后，导致了蛋白质的变性，同时共价键遭到破坏而水解，从而引起体系中部分游离氨基酸含量的升高[2,4]。比较F1和F2的6种乳样品，PRO、CYS、MET、LYS和PHE这5种氨基酸的含量均无显著差异，而HIS、GLY和ARG的含量在同一工厂的巴氏乳和UHT乳之间差异不显著，但是两个工厂之间差异显著，这种差异主要是乳源的不同造成的。乳中游离氨基酸的含量受牧群种类、成熟度、饲料、季节以及加工方式的影响[2,4,10-13]。综合来看，巴氏杀菌和UHT杀菌对乳中的游离氨基酸总量的影响不显著。

表2 巴氏乳和UHT乳中游离氨基酸的组成和含量 mg/100g

2.1.3 维生素C和泛酸

维生素C具有抗氧化，清除自由基，解毒，预防缺铁性贫血和癌症等作用[14]，但维生素C极不稳定，在加工和贮藏过程中容易发生氧化分解。泛酸又称维生素B5，在人体内主要以辅[15]酶A(CoA)的形式参与机体糖、脂和蛋白质的代谢。牛乳含有丰富的维生素，其中维生素C极易被氧化，热稳定性最差[16]，泛酸对热和光不敏感[17]，因此选择这两种维生素分析热处理强度对其含量的影响（见表3）。

与原乳比较，两个工厂的巴氏乳和UHT乳中维生素C都有不同程度的损失，并且维生素的损失程度与热处理强度呈正相关。UHT乳维生素C的损失率（F1∶12.75%，F2∶4.65%）显著地高于巴氏乳（F1∶7.89%，F2∶1.72%）。与原料乳比较，工厂F1的巴氏乳和UHT乳中维生素C的含量显著降低；工厂F2的巴氏乳中维生素C的含量无显著变化，但是UHT乳中维生素C的含量显著降低。生产工艺相同，但是不同工厂所使用的灭菌设备和管路等不同，导致维生素的损失程度有所差别。通常当热处理温度较低时，对维生素C造成的损失较小[18]。

与原料乳比较，两个工厂的巴氏乳和UHT乳中泛酸的含量均有不同程度的增加。工厂F1巴氏乳中泛酸的含量与原料乳相当，但是UHT乳的泛酸含量提高了1.73倍；工厂F2巴氏乳和UHT乳的泛酸含量分别提高了1和3.19倍。在牛乳中大约25%的泛酸是与蛋白质结合的[17]。采用高效液相方法测定的是游离态泛酸。热处理之后乳中泛酸含量的升高可能是由于泛酸结合蛋白被破坏，导致了泛酸的释放，并且游离态泛酸的释放量与热处理强度正相关[17]。泛酸的主要生理活性来源于CoA和泛酰巯基乙胺中半胱胺的-SH基，它是酰基或乙酰基残基结合的活性位点。此外，游离态泛酸是精氨酸、亮氨酸和甲硫氨酸合成中的关键性原料[17]。UHT杀菌有利于游离态泛酸从蛋白结合态中被释放出来，因此UHT乳中的泛酸更容易被人体吸收和利用。

表3 巴氏乳和UHT乳中维生素C和泛酸含量

2.1.4 钙的释放和利用率

钙在牛乳中以胶体相和溶解相存在，二者处于动态平衡。钙的存在形式和含量能够直接影响酪蛋白胶束的稳定性，进而改变牛乳的理化特性[19]。经过巴氏和UHT杀菌后乳中总钙和游离钙的含量变化（见表4）。6个牛乳样品中的总钙含量均在980.00～1133.33 mg/L之间，这与文献报道相一致[20-21]。两个工厂的巴氏乳和UHT乳中总钙的含量差异不显著。这是因为在牛乳中维持着胶体相和水相的矿物平衡，尤其是钙和磷酸盐的平衡，巴氏或UHT热处理之后可能会导致钙的存在形式发生转变，但是这并不会改变体系中总的钙含量[19]。此外，两个工厂巴氏乳和UHT乳中游离钙的含量是81.13～85.73 mg/L，两个工厂的6个牛乳样品之间游离钙的含量差异不显著，牛乳中游离钙的含量占牛乳中总钙的8%，这与文献相一致[20,22]。巴氏乳和UHT乳中游离钙与结合钙的比例与原料乳差异不显著。牛乳中盐的平衡和热处理强度息息相关，加热条件温和时，钙和磷酸盐的平衡是可逆的，长时间的高温热处理，则会发生不可逆或者部分可逆的变化[23]。牛乳在热处理后的冷却过程中，胶体相的钙和磷等盐类会发生可逆的变化，游离钙和磷的含量在经历24 h后几乎恢复到与热处理前一致，其恢复的水平因冷却温度的不同而有所不同[24]。结果表明，巴氏或者UHT杀菌并不足以使乳中游离钙发生不可逆的变化，游离钙和结合钙的比例基本维持不变。

表4 巴氏乳和UHT乳中钙的分布

2.2 热处理对牛乳物理性质和感官性质的影响

2.2.1 粒径

乳中脂肪球和酪蛋白胶束的尺寸是影响乳液稳定性和口感的重要因素[25-26]。利用qNano粒度分析仪搭配不同尺寸的纳米滤芯对乳中颗粒进行粒径分析。牛乳样品的粒度如表5所示。F1和F2工厂原料乳中酪蛋白胶束的尺寸相近，均在是130～135 nm之间。这与文献报道相一致[25,27]。与原料乳比较，巴氏杀菌之后，F1和F2中酪蛋白胶束的尺寸均增加了30 nm，是由于乳中热敏性的乳清蛋白在巴氏加热过程中沉积到酪蛋白胶束上，造成酪蛋白胶束的聚集[27]。F1工厂UHT乳中酪蛋白胶束的尺寸比巴氏乳有一个2 nm的增长，而F2工厂UHT乳和巴氏乳中酪蛋白胶束尺寸相当，这可能与两个工厂的热处理工艺有关。乳清蛋白的变性程度与加热强度有关[1]，更多变性的乳清蛋白会与酪蛋白发生聚集，从而导致酪蛋白胶束尺寸增大[28]。

表5 使用200、800和4000 nm孔径滤芯测量的乳样品的平均粒度 nm

F1和F2工厂原料乳的乳脂平均尺寸均为3.1μm，这是乳中脂肪球的大小[29]。两个工厂巴氏乳和UHT乳的脂肪球平均粒径较小，在0.61～0.64μm之间。由于巴氏乳和UHT乳在热杀菌之前有均质处理，均质工艺通过剪切、撞击和空穴效应等显著地降低了乳脂肪球的尺寸[26]。相较于巴氏乳，UHT乳脂肪球的直径降低了20～30 nm，UHT乳的热强度高，造成了乳脂肪球表面的脂肪球膜的破裂，以及小球内甘油三酯的释放[30]。因此，巴氏热处理对乳中酪蛋白胶束和乳脂肪球粒径无显著改变，UHT热处理对酪蛋白胶束的粒径改变不显著，但是可能会导致乳脂肪球的破碎，从而造成乳中脂肪球平均粒径的减小。

2.2.2 黏度

牛乳的黏度是牛乳在加工和输送过程中是需要加以考虑的一个重要特征指标。表6给出了巴氏乳和UHT乳在剪切速率分别为10 s-1和50 s-1时的黏度，每个样品的重复测量的平均值被记录。所有牛乳样品均显示出牛顿流体行为，即黏度与剪切速率无关。工厂F1和F2中原料乳、巴氏乳和UHT乳的黏度均依次增大。这是因为牛乳在巴氏和UHT热处理过程中脂肪球熔化，乳清蛋白变性并吸附在酪蛋白表面，当乳样品恢复到室温后进行测量时，大量熔化的乳脂和变性的蛋白聚集成新的乳脂肪球，但是表面较加热前更粗糙，摩擦力更大，造成巴氏乳和UHT乳的黏度上升，该过程与热处理强度相关，UHT乳的加热温度更高，脂肪熔化量更大，测得冷却后UHT乳的黏度越大。此外，热处理还使得乳中易变性的乳清蛋白同酪蛋白发生了凝胶化反应，酪蛋白胶束发生聚集，胶束的粒径增大，强化了酪蛋白胶束之间的空间位阻效应，进而对热处理后牛乳的黏度造成影响[28]。也有研究表明，巴氏杀菌过程中牛乳的黏度和脂肪球表面张力的改变有关[31]。工厂F1和F2的牛乳样品在进行相同的热处理之后黏度的变化是一致的，热处理之后乳的黏度增大，UHT乳的黏度最大，巴氏乳次之。

表6 巴氏乳和UHT乳的黏度

2.2.3 感官评价

热处理之后的牛乳中含有酮、醛、硫化物、苯环类和萜类等组分，其风味和色泽等也会发生改变[32]。以原料乳为对照，分析了巴氏乳和UHT乳感官品质如图1所示。对于F1的乳样品，原料乳具有巴氏奶味、甜味、厚实、黄油、奶油5个基本属性，还有比较明显的油腻感、咸味、奶腥味和蒸煮味，共9个属性。这主要来源于原料乳中醛、酮、酸、酯、醇以及烷烃类等风味物质[32-33]。巴氏乳除了这9个属性外，新出现了涩感和粉感。这是因为巴氏加热后，长链脂肪酸会生成酯类物质，此外一些酮酸和羟基会分别形成甲基酮和内酯类化合物[34]。UHT乳与巴氏乳相比无奶腥味，但新出现了椰子味。UHT的更高强度热处理会生成多种独特风味物质，例如，由亚油酸氧化而生成的2-庚酮，它是UHT乳风味的主要成分，赋予了UHT乳奶油气味；辛酸乙酯赋予了水果香和椰子香味[32]，这可能是UHT乳椰子味的主要来源。

图1 巴氏乳和UHT乳的感官评价雷达图

对于F2的乳样品，原料乳相较于F1新出现了涩感，共10个属性。巴氏乳相较于原料乳，油腻感、咸味和奶腥味消失，新出现了椰子味。UHT乳相较于原料乳油腻感和涩感消失，但新出现了粉感和苦味。粉感可能是由于加热导致的酪蛋白与脂肪的团聚，而苦味主要来源于在加热条件下由色氨酸和苯丙氨酸转化而来的苯甲醛[32,35]。巴氏乳在巴氏奶味、甜味、厚实3个重要属性上强度更高一些；UHT乳在油脂属性强度上稍高一些。两个工厂比较，工厂F1的UHT乳的风味得分较高，而F2的巴氏乳得分更高，风味受原料乳的质量影响较大。

3 结论

牛乳经过巴氏和UHT热处理后，乳中的蛋白质、糖类、脂质、维生素等风味前体物质会发生不同程度、不同形式的理化反应。巴氏乳和UHT乳营养成分与原料乳比较变化不显著；热处理改变了乳中营养成分的结构和存在形式，这些改变会直接影响加工乳的粒度、黏度以及感官特性。因此，在保证合理控制乳中有害微生物的同时，最大程度的降低营养成分的损失和保持乳的物理和感官特征是热处理工艺优化的主要原则。