周海岩,周斌,邹树平,张博,柳志强*

1(浙江省生物有机合成技术研究重点实验室(浙江工业大学),浙江 杭州,310014)2(手性生物制造国家地方联合工程研究中心(浙江工业大学),浙江 杭州,310014)

D-泛酸是水溶性的B族复合维生素(B5),作为合成辅酶A和酰基载体蛋白的一种前体发挥作用[1-2]。作为一种重要的生长因子,D-泛酸参与碳水化合物、蛋白质和脂肪酸的代谢[3]。目前,D-泛酸被广泛用于医药、食品、饲料工业等领域[4-5]。

D-泛酸的生产方法主要包括物理诱导结晶法、化学拆分法和生物法。物理诱导结晶法工艺成熟,但只能生产泛酸钙,无法用于其他泛酸衍生物的生产。化学拆分法是目前最主要的合成方法,但拆分剂价格昂贵,分离困难,还存在毒性和环境污染问题[6-7]。通过合理运用微生物或酶来生产D-泛酸,不仅能够保证泛酸的拆分质量而且还能减低反应成本[8],相较化学法,生物法具有更加绿色环保的优点[9]。生物酶法是利用泛酸合成酶催化D-泛解酸和β-丙氨酸进行缩合反应生成D-泛酸,反应条件温和,没有副产物的生成,更有利于产品分离[10-12]。20世纪90年代,就有学者开始研究生物发酵法生产D-泛酸,并取得了一定的成果。但是目前D-泛酸的产量尚未达到工业化生产的要求,主要原因是D-泛酸代谢途径长、分支代谢多,目的产物D-泛酸的积累量不高[13];其次,在D-泛酸合成过程中,需要很多前体物质,对培养基要求和发酵控制比较苛刻[14-16]。

本文以实验室前期构建的E.coliDPA21/pBCST3为D-泛酸生产菌株,在5 L发酵罐水平进行关键发酵参数的优化,主要包括在分批发酵实验中对发酵温度、pH、转速进行优化,以及在补料分批发酵实验中对葡萄糖和β-丙氨酸的流加方式和浓度进行优化,以进一步提高D-泛酸的产量,初步建立高效的发酵调控工艺,为后期的工业化生产提供依据。

1 材料与方法

1.1 菌种

E.coliDPA21/pBCST3,保藏于浙江工业大学生物工程研究所。E.coliDPA21的基因型为DPA17ΔpoxB ΔpflB ΔldhA ΔilvE。

1.2 培养基

种子培养基(LB培养基)(g/L)：蛋白胨10、酵母粉5、NaCl 10。

发酵培养基：葡萄糖30 g/L、(NH4)2SO416 g/L、KH2PO42 g/L、酵母粉2 g/L、金属盐溶液1 mL/L、L-异亮氨酸20 mg/L、MgSO4·7H2O 1.0 g/L、异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside,IPTG)0.2 mmol/L、卡那霉素(kanamycin,Kan)50 mg/L、维生素B15 mg/L、维生素B122 mg/L、β-丙氨酸 3 g/L。

金属盐溶液(g/L)：CaCl210、FeSO4·7H2O 10、ZnSO4·7H2O 1、CuSO40.20、NiCl2·7H2O 0.02。

补料培养基：葡萄糖500 g/L、(NH4)2SO410 g/L、KH2PO414 g/L、酵母粉2 g/L、金属盐溶液1 mL/L、L-异亮氨酸 20 mg/L、MgSO4·7H2O 16 g/L、IPTG 0.2 mmol/L、Kan 50 mg/L、维生素B15 mg/L、维生素B122 mg/L;根据需要添加质量浓度为30～50 g/L的β-丙氨酸。

1.3 培养方法

1.3.1 种子培养

从培养成熟的平板中挑出单一的菌落,接入到装有50 mL种子培养基(含有50 mg/L Kan)的500 mL三角瓶中,于37 ℃、150 r/min培养14 h。

1.3.2 发酵罐发酵培养

按照15%的接种量将种子液接入5 L发酵罐中进行发酵培养。发酵罐装液量为2 L,培养温度(30±1)℃,通气量为1.5 vvm,流加30%的氨水和30%的磷酸溶液自动控制pH使其维持在(6.8±0.1),初始搅拌转速为400 r/min,后期通过偶联搅拌转速对溶氧(dissolved oxygen,DO)(维持在15%左右)进行调节,直到发酵结束。

流加培养：在分批发酵的基础上,根据实验设定来补加补料培养基。

1.4 分析方法

1.4.1 细胞浓度测定

取适量的发酵液用蒸馏水进行适当的稀释后,用Eppendorf BioPhotometer测量600 nm处的吸光值(OD600),使用发酵液上清液作为对照,根据标准曲线换算成菌体干重(dry cell weight,DCW),按公式(1)计算：

DCW(g/L)=0.393 5×OD600+0.014 8

(1)

1.4.2 葡萄糖含量检测

葡萄糖浓度采用DNS法[17]进行检测。

1.4.3D-泛酸检测

将发酵液样品在12 000 r/min离心5 min,取1 mL上清液按照一定的比例进行稀释使D-泛酸的含量检测值在仪器的检测范围内;通过无菌滤膜过滤后,D-泛酸的浓度使用HPLC进行检测。

HPLC检测条件：仪器为日本日立(HITACHI)公司Primaide,色谱柱型号为Eclipse XD8-C18(5 μm,4.6 mm×250 mm),柱温30 ℃,检测器为紫外检测器,检测波长210 nm,流动相体积比A(磷酸)∶B(乙腈)∶C(水)=1∶50∶950,流速0.9 mL/min,进样量10 μL。

1.5 数据处理

数据用Excel和Origin 2018软件处理。

2 结果与分析

2.1 5 L发酵罐分批培养条件的优化

2.1.1 不同培养温度对产D-泛酸的影响

温度是影响微生物生长和存活的主要环境因素之一,温度对发酵的影响主要表现在对细胞生长、产物合成、发酵液的物理性质和生物合成方向等方面。为确定最佳发酵温度,在其他条件不变的条件下,分别设置不同的温度(27、30、33 ℃)进行分批发酵实验。

如图1所示,在3种不同的温度下,菌体生长情况在发酵后期无显著差别,葡萄糖在22 h左右消耗完,此时细胞干重开始呈现稳定趋势。但由于D-泛酸的生物合成与菌体生长并不是完全耦合的,在基质消耗完全后仍会利用发酵液中的有机酸(D-泛解酸、α-酮戊二酸和α-酮异戊酸)和氨基酸(β-丙氨酸、L-谷氨酸)等其他物质继续合成D-泛酸,最终产量分别达到5.31、7.30和6.56 g/L。当发酵温度从27 ℃升高至30 ℃时,D-泛酸产量随之增加;随着发酵温度的进一步升高(33 ℃),D-泛酸产量随之下降,原因可能为高温会影响D-泛酸合成途径中一些关键酶的活力。因此,选择30 ℃作为分批发酵的温度。

a-菌体生长;b-D-泛酸生产;c-葡萄糖消耗图1 不同培养温度下D-泛酸发酵参数Fig.1 Fermentation parameters of D-pantothenic acid at different temperatures

2.1.2 不同pH对D-泛酸生产的影响

随着菌种对培养基中碳、氮源的利用以及有机酸和氨基酸的积累,培养液的pH会发生一定的变化。pH值主要影响菌体内某些关键酶的活性,从而影响产物的产量。pH对D-泛解酸内酯水解酶活力影响显著[18],而D-泛酸内酯水解酶是泛酸合成中的关键酶,当pH为6.0～7.5时最有利于D-泛酸的合成。因此本实验选择pH为6.2～7.4进行研究。

由图2可知,在pH 6.2～7.4,pH为6.8时的菌体生长和D-泛酸合成量在整个培养过程中均略高于其他pH值时的水平,因此,选择pH 6.8作为发酵pH。

a-菌体生长;b-D-泛酸生产;c-葡萄糖消耗图2 不同pH条件下D-泛酸发酵参数Fig.2 Fermentation parameters of D-pantothenic acid at different pH

2.1.3 不同DO对D-泛酸生产的影响

如图3所示,在发酵的前12 h,菌体生长情况基本一致,而发酵12 h后呈现不同的变化降势,5%、15%和25%条件下的DCW分别为7.08、7.57和7.44 g/L。DO为5%时菌体量较低,这说明搅拌转速过低可能会造成供氧不足,从而影响菌体生长;而过高的转速会产生剪切力,对菌体造成一定损伤,使其过早衰亡或自溶[20]。而18 h后,DO为15%时的D-泛酸产量高于其他2个溶氧条件下的产量,综合考虑菌体生长、D-泛酸产量以及工业生产中能耗的因素,选择15%作为分批发酵的溶氧水平。

a-菌体生长;b-D-泛酸生产;c-葡萄糖消耗图3 不同DO条件下D-泛酸发酵参数Fig.3 Fermentation parameters of D-pantothenic acid at different DO levels

2.2 β-丙氨酸补料方式和浓度对发酵的影响

在发酵参数确定的基础上,对β-丙氨酸的补料方式进行优化。主要分为β-丙氨酸与糖混合流加和β-丙氨酸单独流加2种方式,β-丙氨酸的质量浓度为30、40、50 g/L。

由图4和图5可知,在2种不同的β-丙氨酸补料条件下,D-泛酸的最高产量均在β-丙氨酸质量浓度40 g/L时,混合流加方式下最高产量为40.25 g/L,高于分开流加时的27.38 g/L。比较在同一种β-丙氨酸流加方式不同浓度时,发现在发酵20 h左右,即开始补糖时,D-泛酸的合成速率出现差异,流加质量浓度为50 g/L时,D-泛酸合成速率最高,但快速进入生产稳定期。流加质量浓度为40 g/L时,D-泛酸合成速率先增大后减小,缓慢进入稳定期。当流加质量浓度为30 g/L时,D-泛酸的合成速率较补料前有所下降,但D-泛酸产量一直处于缓慢增长状态。说明β-丙氨酸的流加浓度对D-泛酸的合成有显著的影响。原因可能为在20 h左右菌体内合成D-泛酸的相关酶活力较高,能够将较高浓度的β-丙氨酸转化合成D-泛酸。在35 h左右,菌体的活力开始下降,不能够迅速地将β-丙氨酸进行转化,此时,β-丙氨酸消耗速率小于补给速率,使胞外β-丙氨酸大量积累,从而抑制D-泛酸的合成。

a-30 g/L;b-40 g/L;c-50 g/L图4 混合流加方式下β-丙氨酸的浓度优化Fig.4 Optimization of β-alanine concentration in mixed feeding mode

a-30 g/L;B-40 g/L;C-50 g/L图5 单独流加方式下β-丙氨酸的浓度优化Fig.5 Optimization of β-alanine concentration under separate feeding mode

2.3 葡萄糖补料方式优化

在β-丙氨酸的补料工艺确定的基础上,对补糖工艺进行优化。葡萄糖作为一种重要的发酵底物,对微生物生长和代谢至关重要。从前期的分批发酵实验中发现,在D-泛酸分批发酵结束时,菌体生长和D-泛酸合成都没有出现快速的下降。因此在葡萄糖耗尽之前如果及时补充葡萄糖,将可以提高产物转化率。目前,葡萄糖的流加方式有很多种,本实验结合D-泛酸合成的特性,采用2种补料方式,即脉冲补料和匀速补料进行D-泛酸的发酵。理论上较低的葡萄糖浓度更有利于发酵[21],根据前期的预实验和ZHANG等[16]的研究,发现糖质量浓度维持在5 g/L左右时有利于D-泛酸的积累。所以当残余葡萄糖质量浓度下降到5 g/L或以下时开始进行葡萄糖流加。

2.3.1 不同脉冲浓度对D-泛酸发酵的影响

由图6可知,在3种不同脉冲(5～10、5～20、5～30 g/L)条件下,DCW变化趋势相似。在发酵后期,当脉冲质量浓度为5～30 g/L时,D-泛酸的合成早于其他2种条件下达到平衡,但产量较低;而脉冲质量浓度为5～10 g/L时,D-泛酸的产量明显高于其他2种条件下的水平,达到41.5 g/L,表明低浓度的葡萄糖更有利于D-泛酸的合成。

a-5～10 g/L;b-5～20 g/L;c-5～30 g/L图6 不同脉冲糖浓度对D-泛酸发酵的影响Fig.6 Effects of different pulsed glucose concentrations on D-pantothenic acid production

2.3.2 不同恒速补糖对D-泛酸发酵的影响

分别以2.0、2.5和3.0 g/(L·h)进行匀速补糖。由图7-a可知,当补糖速率为2.0 g/(L·h)时,发酵过程中出现较长时间的低糖(<5 g/L)阶段,菌体生长较缓慢。而当补糖速率为2.5 g/(L·h)时(图7-b),糖质量浓度可以很好地控制在5～10 g/L,菌体生长速率也相对更快,最终D-泛酸产量达到32.33 g/L。而当补糖速率为3.5 g/(L·h)时(图7-c),发酵后期由于补糖速率超过菌体耗糖速率,发酵液中糖浓度过高而导致菌体生长和D-泛酸受到影响。总体而言,在匀速补料条件下,D-泛酸的最高产量(32.33 g/L)明显低于间歇性补料(5～10 g/L)的最高产量(41.5 g/L)。因此,最佳的葡萄糖流加方式为脉冲补料,质量浓度为5～10 g/L。

a-2.0 g/(L·h);b-2.5 g/(L·h);c-3.0 g/(L·h)图7 不同匀速补糖对D-泛酸发酵的影响Fig.7 Effects of different rates of glucose supplementation on D-pantothenic acid production

3 结论

通过对D-泛酸发酵培养条件进行考察,确定5 L发酵罐的最佳培养条件为温度30 ℃、pH 6.8、DO 15%,确定了最佳的β-丙氨酸流加方式,即与葡萄糖溶液混合流加,且β-丙氨酸质量浓度最佳为40 g/L。在此基础上,通过比较脉冲补料和匀速补料方式确定葡萄糖以5～10 g/L的质量浓度进行脉冲式补料对于提高D-泛酸的产量效果更好,D-泛酸的最高产量达到41.5 g/L。后续需进一步缩短反应时间,简化发酵操作流程来提高产量以达到工业化生产标准。