陆娟，刘晶晶，战姝妍

(本溪市中心医院，辽宁本溪117000)

卵巢癌是一种严重威胁全球妇女健康的恶性肿瘤，在妇科恶性肿瘤中其发病率居第二位、病死率居第一位。卵巢癌起病隐匿，早期不易被发现且易转移，患者预后往往较差[1]。目前，关于卵巢癌的病因尚不完全清楚。因此，探索卵巢癌形成与恶性进展的分子机制成为当前临床研究的热点之一。长链非编码RNA(lncRNA)是一类转录本长度超过200 nt、不具有编码蛋白质功能的RNA分子，而是以RNA的形式在表观遗传、转录及转录后等层面调控基因的表达，继而参与机体一系列的生理和病理生理过程[2，3]。近年研究发现，lncRNA在肿瘤的发生、发展过程中亦具有重要作用[4]，有可能成为某些恶性肿瘤的特异性生物标志物和潜在的治疗靶点。核富集转录体1(NEAT1)是一种长度约3.2 kb的lncRNA，主要富集于细胞核中，是形成与维持细胞核亚结构paraspeckle的关键lncRNA。有研究证实，lncRNA NEAT1可参与多种肿瘤的发生、发展过程[5]。羧基末端结合蛋白2(CtBP2)是进化上高度保守的辅助转录抑制因子，能通过下调特定的肿瘤抑制因子，参与多种恶性肿瘤的发生、发展[6]。但目前lncRNA NEAT1、CtBP2在卵巢癌形成和恶性进展中的作用尚不清楚。本研究观察了卵巢癌组织lncRNA NEAT1、CtBP2表达变化，并探讨其表达与患者临床病理特征和预后的关系。现报告如下。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选择2013年3月～2015年12月本溪市中心医院收治的卵巢癌患者76例。所有患者经术后组织病理检查明确诊断。纳入标准：①符合原发性卵巢癌诊断；②根据病情行全面分期手术或肿瘤细胞减灭术；③初诊，术前未行任何抗肿瘤治疗。排除标准：①合并其他部位恶性肿瘤者；②术前接受抗肿瘤治疗者；③年龄>70岁者；④治疗依从性差者；⑤术后失访或因意外去世者。其中，年龄20～69(54.32±7.18)岁，≤55岁45例、>55岁31例；肿瘤直径：≤3 cm 42例，>3 cm 34例；病理类型：浆液性51例，黏液性20例，其他5例；FIGO分期：Ⅰ期28例，Ⅱ期33例，Ⅲ、Ⅳ期15例；有淋巴结转移53例，无淋巴结转移23例。同期选择本溪市中心医院收治的卵巢良性囊肿患者20例，年龄23～70(55.19±6.65)岁。两组年龄具有可比性。本研究经本溪市中心医院医学伦理委员会批准，患者或其家属知情同意。

1.2 lncRNA NEAT1、CtBP2表达检测 采用RT-PCR法。取手术切除或剥离的卵巢癌组织与卵巢囊肿组织，液氮下碾磨成粉末，采用TRIzol法提取组织总RNA，经紫外分光光度计鉴定，OD260/OD280为1.8～2.0，可用于后续实验。按照RevertAidTMFirst Strand cDNA Synthesis Kit说明，将提取的总RNA逆转录为cDNA。以cDNA为模板，按SYBR Green荧光定量PCR试剂盒说明进行PCR扩增。所有引物由沈阳万类生物科技有限公司设计合成。引物序列：lncRNA NEAT1上游引物5′-GGGATGATGCAAACAATTAC-3′，下游引物5′-TACCATACAGAGCAACATAC-3′；CtBP2上游引物5′-ATCCACGAGAAGGTTCTAAACG-3′，下游引物5′-CCGCACGATCACTCTCAGG-3′；GAPDH上游引物5′-CACCCACTCCTCCACCTTTG-3′，下游引物5′-CCACCACCCTGTTGCTGTAG-3′。PCR反应体系共25 μL：2×SYBR Green qPCR Mix 12.5 μL，上下游引物各0.5 μL，模板cDNA 2 μL，去离子水9.5 μL；反应条件：95 ℃ 15 min，95 ℃ 15 s、60 ℃ 40 s共40个循环。以GAPDH为内参，采用2-ΔΔCT法计算目的基因相对表达量。实验重复3次，取平均值。

1.3 随访 卵巢癌患者术后采用电话或门诊等方式定期随访，随访截至2018年12月，随访时间9～60个月、中位随访时间33个月。以卵巢癌组织lncRNA NEAT1或CtBP2相对表达量的均数为截断值，高于截断值为高表达、低于截断值为低表达，统计不同lncRNA NEAT1或CtBP2表达者生存时间和生存率。

2 结果

2.1 卵巢癌组织与卵巢囊肿组织lncRNA NEAT1、CtBP2表达比较 卵巢癌组织与卵巢囊肿组织lncRNA NEAT1相对表达量分别为0.619±0.115、0.079±0.021，CtBP2相对表达量分别为0.330±0.066、0.112±0.014。卵巢癌组织lncRNA NEAT1、CtBP2相对表达量均明显高于卵巢囊肿组织(t分别为20.831、14.631，P均<0.01)。

2.2 卵巢癌组织lncRNA NEAT1表达与CtBP2表达的关系 Pearson相关分析显示，卵巢癌组织lncRNA NEAT1相对表达量与CtBP2相对表达量呈正相关关系(r=0.689，P<0.01)。

2.3 卵巢癌组织lncRNA NEAT1、CtBP2表达与患者临床病理特征的关系 卵巢癌组织lncRNA NEAT1、CtBP2表达均与肿瘤FIGO分期、淋巴结转移有关(P均<0.05)，而与患者年龄、肿瘤直径、病理类型无关(P均>0.05)。见表1。

表1 卵巢癌组织lncRNA NEAT1、CtBP2表达与患者临床病理特征的关系

2.4 卵巢癌组织lncRNA NEAT1、CtBP2表达与患者预后的关系 以卵巢癌组织lncRNA NEAT1或CtBP2相对表达量的均数为截断值，将患者分为lncRNA NEAT1高表达者34例、低表达者42例，CtBP2高表达者35例、低表达者41例。至随访截至日期，lncRNA NEAT1高表达者与低表达者生存率分别为47.06%(16/34)、71.81%(31/42)，生存时间分别为(35.85±3.57)、(52.38±3.06)个月，lncRNA NEAT1高表达者生存率和生存时间均低于lncRNA NEAT1低表达者(χ2/t分别为5.698、21.731，P均<0.05)；CtBP2高表达者与低表达者生存率分别为48.57%(17/35)、73.17%(30/41)，生存时间分别为(37.54±3.66)、(52.28±3.03)个月，CtBP2高表达者生存率和生存时间均低于CtBP2低表达者(χ2/t分别为4.842、19.209，P均<0.05)。

3 讨论

据调查，我国卵巢癌发病率占女性恶性肿瘤的第8位，居世界第85位，处于较低水平[7]。但由于卵巢癌病死率较高，5年生存率仅30%左右[8]，故仍然是严重威胁我国妇女健康的重要疾病之一。近年来随着我国经济发展，居民饮食结构和生活方式改变，卵巢癌的发病率正逐年上升并呈年轻化趋势[9]。由于卵巢癌的病因尚不完全清楚，缺少有效的预防措施。因此，探索卵巢癌形成与恶性进展的分子机制成为当前临床研究的热点之一。

lncRNA是广泛分布于真核生物体内的一类非编码RNA，约占转录本的93%[10]。lncRNA序列长，结构复杂，虽然不编码蛋白质，但特定的lncRNA能够参与调控蛋白的转录或转录后表达[2,3]。NEAT1是近年发现的一种在人体细胞核内表达的lncRNA，是形成与维持细胞核亚结构paraspeckle的关键lncRNA。有研究发现，lncRNA NEAT1可通过调控多种基因的表达，参与机体的免疫调控及恶性肿瘤的发生、发展[11～13]。Chai等[14]研究发现，lncRNA NEAT1能够促进卵巢癌OVCAR-3细胞增殖和侵袭，而敲除lncRNA NEAT1的卵巢癌OVCAR-3细胞增殖和侵袭明显受到抑制。本研究结果显示，卵巢癌组织lncRNA NEAT1相对表达量明显高于卵巢囊肿组织；卵巢癌组织lncRNA NEAT1表达与肿瘤FIGO分期、淋巴结转移有关。与Chai等[14]体外研究结果一致，提示lncRNA NEAT1可参与卵巢癌形成与恶性进展。进一步研究发现，lncRNA NEAT1高表达者生存率和生存时间均低于lncRNA NEAT1低表达者，表明lncRNA NEAT1高表达与卵巢癌患者预后不良有关。因此，lncRNA NEAT1有可能成为预测卵巢癌患者预后的指标之一。

CtBP家族因可与E1A蛋白的碳基末端五个氨基酸序列结合而得名，在进化上高度保守，是一类辅助转录抑制因子[15]。CtBP家族有多个亚型，CtBP2是其中的重要一员，基因定位于染色体21q21.3[6]。CtBP2的中心结构域可与烟酰胺腺嘌呤二核苷酸结合，碳基末端能够对基因进行翻译后修饰，氨基末端则可特异性识别并结合特定转录抑制因子，三个结构域协同发挥辅助转录抑制因子功能[16～18]。近年研究发现，CtBP2还能参与多种肿瘤的发生、发展。Zhang等[19]研究发现，CtBP2能够通过抑制c-Myc信号通路促进前列腺癌细胞增殖；而Takayama等[20]研究发现，CtBP2还能通过调控雄激素受体活性促进前列腺癌恶性进展；Dai等[21]研究发现，过表达CtBP2能够促进胃癌细胞上皮间质转化，从而促进肿瘤细胞增殖和侵袭。本研究结果显示，卵巢癌组织CtBP2相对表达量明显高于卵巢囊肿组织；卵巢癌组织CtBP2表达与肿瘤FIGO分期、淋巴结转移有关。与上述文献[19～21]报道基本一致，提示CtBP2可参与卵巢癌形成和恶性进展。进一步研究发现，CtBP2高表达者生存率和生存时间均低于CtBP2低表达者，表明CtBP2高表达与卵巢癌患者预后不良有关。因此，CtBP2有可能成为预测卵巢癌患者预后的指标之一。

Li等[22]研究发现，lncRNA NEAT1能够通过调控miR-129/CtBP2轴，增强食管鳞癌细胞活性并促进肿瘤细胞侵袭。本研究结果发现，卵巢癌组织lncRNA NEAT1表达与CtBP2表达呈正相关关系。因此推测，CtBP2可能是lncRNA NEAT1参与卵巢癌发生、发展的下游基因位点，但其具体机制尚需进一步研究。

综上所述，卵巢癌组织lncRNA NEAT1、CtBP2高表达，二者表达变化可能协同促进肿瘤恶性进展并导致患者预后不良。lncRNA NEAT1、CtBP2有可能成为卵巢癌早期诊断和预后监测的生物标志物。